加减法DNA测序整个过程和化学测序的过程（Z好有图片说明）

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  幻雪夜57 2016-12-01 23:38:49

  以下都是思路，具体的反应和实验细节，假如思路清楚后，随便找一本实验书就可以明白。这两种方法，思路上很简单，很多教科书，特别是实验书上都有图可参考。因为不懂，所以更要多看多翻多想。 【下面的回答，有谬误，请大家指正和完善】 ------------------------------------------------------------------- 加-减法（plus-minus sequencing）: Sanger于1975年发明，使人们有可能diyi次“读”出DNA的碱基序列。 首先，在做“加法体系”和“减法体系”以前的工作。 待测DNA的单链作为模板，一个合适的引物，四种dNTP，用同位素标记。 DNA聚合酶从引物开始合成一条互补链，理想情况是，合成所产生各种长度的片段都存在。 然后除去那些未参与合成的dNTP，将剩下的合成产物，分成两部分。 一部分用于加法系统，一部分用于减法系统。 加法系统：将用于加法系统的产物再分成四小份，每一小份中仅仅将四份中的dNTP的一种加入反应体系。比如仅加入dATP。由于DNA由聚合酶具有3′→5′的外切酶活性，而反应体系中缺少另外三种必要的dNTP，合成产物就从3′→5′方向降解。然而由于存在dATP，显然遇到dA的位置降解反应就停止了。因而所有的片段都是以A结尾的。同理，可以分别制备以C、G或T结尾的另外三组片段。 四组片段在同一块凝胶板的不同样品槽中同时电泳（这类图LZ可以在书上随便找到），从放射自显图上就可以推断出碱基序列，因为从A样品槽查出的放射性区带代表A在片段中的位置，同理也可定出C、G和T的位置。 【加法系统实际就是以降解为条件，以DNA聚合酶的3′→5′的外切酶活性为基础，当降解过程遇到试剂中所富含的dNTP时，反应就停止】 按理只用一个加法系统就足以推断DNA的碱基序列了。但由于技术上的原因，只用一种方法有时不能得到完全正确的结果，因此又设计了一种减法系统。 减法系统：也是将上述酶促产物分成四小份，每一小份中只加入三种dNTP，比如缺少dATP。在这个反应体系中，DNA聚合酶能够把片段继续合成下去，但是在遇到应该是dATP参入的位置时，合成反应就停下来了。这就可以得到一个都是以A前一个位置为结尾的片段组，电泳后同样可以定出A的位置。 【减法系统实际就是以合成为条件，当合成过程缺少需要的dNTP时，反应就停止】 但此加减法并不尽如人意，由于反应速度上的差异，有些片段可能多些，另一些片段可能少些，有时可能导致漏读和重读，有时图谱上还会出现假谱线，当同样碱基排列时图谱上有时只出现一条带。因此用这个方法测定DNA片段可能有1/50的误差。目前常用的是它的改进法-双脱氧末端终止法。 剩下的就是读板的问题，可以想到，在理想情况下，比如以A结尾的各种长度的片段，出现的可能性是均等的。那么在聚丙烯酰胺凝胶电泳中，相对分子量小的片段迁移速度快。书上的图，都是一块板子，有四个列，分别是以四种不同结尾的核苷酸的电泳情况。跑在越前面的（也就是Z靠近底部的），就diyi个被读出来，随后的相对分子量不断增大，迁移速度慢，也就是比较大的片段，按其顺序和所处的列，就克直观读出序列。 --------------------------------------------------------------------- 【化学法（chemical method）】由Maxam-Gilbert在1977年发明。 一、取待测DNA片段，既可以是单链也可以是双链。 此法又叫化学切割法，或化学降解法，切割之前先对待测片段作末端标记。用放射性P32-磷酸集团标记链的末端之一。 二、将标记完的样品，分成四份。分别采用不同的化学试剂对所得样品，进行修饰进而切割【切割就是利用特异的化学试剂，修饰DNA分子中不同的碱基，使被修饰的碱基之间的连接变得不稳定，发生断裂，而产生各种长度的DNA片段。】 【四组切割的方法，在G、G+A、T+C、C处切割】 “+”就是同时切割，有点讨厌的是这点，能修饰A，使其糖苷键不稳定的甲酸，同时也会使G的不稳定，所以无奈就有了G+A并在一起， （1）G反应，"硫酸二甲酯"，使鸟嘌呤G的N7原子甲基化，而与脱氧戊糖之间的糖苷键不稳定，可在中性环境中受热断裂，得到一系列G末端的片段。 （2）G+A反应 "甲酸"，使A和G嘌呤环上的N原子质子化，糖苷键变得不稳定，可用哌啶将其断裂，得到一系列A和G混合的末端的片段。 （3）T+C反应 "肼"，使T和C的嘧啶环断裂，通过消除反应，使DNA链发生断裂，得到一系列T+C末端的片段。 （4）C反应 在NaCl存在时，只有C与肼反应，得到一系列C末端的片段。 用上面加减法一样的电泳，克得到结果，直观读出。 至于为什么（2）（3）两步，为什么是G+A、T+C？ 事实上，如果有单独只断A的或只断T的修饰方法，也可以。但从书上列出的图中，可以看出，断裂的混合物G+A、T+C电泳后并不影响读结果。 ---------------------------------------------------------------------

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