案例分享 | Fusion QbD工具轻松解决生物药开发难题

近年来，随着法规的推动，制药人士对于分析方法生命周期的关注度越来越高。USP通则<1220>分析方法生命周期已于2022年5月1日生效，ICH Q14<分析方法开发>也已结束第三阶段公开征求意见阶段。ICH Q14指出，在分析方法开发时，可以使用基础（即传统型）方式或加强型方式。本文案例即使用加强型方式 — Fusion QbD软件辅助生物药分析方法开发。

摘要 

生物药分析部门花费了大量时间开发耐用性好的分析方法，以保证原料药和成品是纯的，稳定的。为了快速将产品应用到患者身上，研发组织不断地加快方法开发流程。提高分析方法开发效率的一个方法就是使用自动筛选和自动方法优化工具。

Fusion QbD软件可支持色谱不同分离模式的自动筛选流程。Fusion允许客户输入与分离模式相关的几个因素进行研究。然后基于统计学设计实验以评估这些因素的影响。设计好的DoE实验可导入Empower，并自动在Empower中创建仪器方法和样品组，减少方法开发过程中大量的人工工作量。Empower运行样品后，结果再一键导入Fusion中做建模分析，评估各色谱参数。

Fusion-Empower工作流程 

在Fusion QbD中生成用户自定义考察因素的DoE实验设计。Fusion将仪器方法写入到Empower中，处理后的样品结果再导入Fusion中分析，得到更优的色谱条件。

图1.  Fusion Empower工作流程

案例1- WCX模式方法开发

• Fusion QbD自动筛选和自动优化；

• 通过Fusion产生69个仪器方法和样品组，并导入到Empower3； 

• 5个小时人工，120小时仪器运行时间；

• DoE实验考察因素：pH、梯度时间、流动相组成、有机添加物、盐浓度和柱温；

• QbD开发的分析方法结果显示：主峰峰形改善，酸性系列峰和碱性系列峰的分离度都提高了；

• 图2为QbD开发好的分析方法和之前传统方式开发了5个月的方法色谱对比图：

图2. WCX 液相分离模式（A. 传统方式开发的分析方法色谱图 ；B. Fusion QbD开发的色谱图，显示酸性系列峰和碱性系列峰的分离度都得到提高）。

案例1 - 叠加图

将Empower结果导入到Fusion中，产生WCX HPLC叠加图。基于客户定义的方法性能指标，白色区域是可接受性能区域，有颜色的区域是不满足性能要求的区域。

图3. 叠加图显示白色区域为满足性能要求的可接受性能区域（左图：盐浓度vs梯度时间。右图：盐浓度vs. pH）。

案例2 - HILIC方法开发 — Fusion QbD筛选

• Fusion QbD产生的38个仪器方法导入到Empower；

• 2个小时人工，15个小时仪器运行时间；

• DoE实验考察的因素：pH、柱温、梯度时间；

• 得到的分析方法显示蛋白1和蛋白2的分离度提高，两个蛋白的拖尾因子降低。

图4. HILIC液相分离模式（A. 传统方法开发的分析方法色谱图；B. Fusion QbD开发的分析方法色谱图，显示蛋白1和蛋白2的分离度提高，拖尾因子降低）。

 结论 

Fusion QbD成功用于生物药的方法开发，首先生成HILIC和阳离子交换模式的DoE实验设计。然后使用Fusion中的导出功能，在Empower中自动创建DoE设计好的仪器方法和样品组。通过自动筛选功能，HILIC方法实现了提高两个蛋白峰的分离度目标，阳离子交换方法实现了分离峰的数量和分离度的提高目标。在Empower3中处理好的结果导入到Fusion，经过统计和建模分析，得到了各个参数的操作空间(MODR)。使用Fusion QbD做方法开发节约的人工，大约为2.5个人工(FTE)一个月的工作时间。

你是否曾在实验室和瓶皿做“斗争”？每次需要清洗瓶子时，都要花费很长时间和精力，却得不到理想的效果。别着急，今天我们为大家介绍一款实验室洗瓶机，无需费尽心思，即可轻松解决实验室中的瓶子清洗难题。

首先，清洗程序，在日常生活中，你可以直接快速操作对应的按键，轻松完成清洗任务。

拥有完善的清洗系统的洗瓶机必须拥有恰当的清洗程序。喜瓶者洗瓶机内置了35个清洗程序，通过编辑，可自定义出100个个性化清洗程序。可自由编辑，清洗程序不再局限于传统的，你可以根据自己的需求进行修改，可对水量、温度、清洗剂、清洗时间等关键参数进行调整。让清洗更加轻松。

微电脑智能控制，喜瓶者洗瓶机操作键面采用OLED显示屏， 不锈钢金属按键，即使湿手或者戴手套也能正常操作，并配有3个快捷清洗程序，可将清洗程序快捷至abc三个快捷键中，使用更加便捷，系统支持中/俄/英三种语言，可任意切换。

清洗篮架：模组模块化篮架，即每层可放置任意两个模块，随意组合，篮架与内腔皆采用316L不锈钢材质，可确保无析出，不生锈。

为了更好地管理实验室的工作效率，提升了工作质量。大家不妨考虑一下，是否需要一个专业的实验室洗瓶机，为自己和同事节省时间和精力。

转载自：http://www.hzxpz.com/

痕量分析用于测定痕量元素在试样中的总浓度，和用探针技术测定痕量元素在试样中或试样表面的分布状况，主要用于测定Pb、As、Hg、Cd、Cr、Ni等痕量元素，常用方法有化学光谱法、中子活化分析法、质谱法、分光光度法、原子吸收光谱法、极谱法等多种方法。主要应用于化学、材料科学、生物医学、环境科学、表面科学等领域。

洁净的样品反应容器是获得正确分析结果的前提。痕量分析所使用的微波消解罐、超级微波消解管、常压消解罐、玻璃器皿（试管、烧杯、容量瓶等）等的痕量清洗，对于实验人员来说，始终是一个非常繁琐而又非常重要的挑战。而酸蒸清洗很好地解决了这个问题。

酸蒸超净清洗是一种自动、密闭、酸蒸汽清洗方法。通过内置可控温加热系统，利用酸蒸汽安全高效地对所有可溶于酸中的任何痕量金属污染物进行超净清洗，并将其留在液体酸中，绝不会接触正在清洗的反应容器。

传统的清洗方式酸缸浸泡，有极大的弊端

1、效率低 效果差，常常要浸泡24小时以上，需多买一套消解管周转，成本极高；

2、酸缸存放困难，大量酸气渗出，污染实验室环境；

3、 为避免交叉污染，需定期换酸，酸消耗量大，且危险；

4、酸泡之后，还需手工冲洗和干燥，繁琐且二次污染。

之后有了微波空消的清洗方式，虽摆脱了长时间酸缸浸泡，但清洗效果一般，且也有一定缺陷。

1、每个消解管清洗需耗纯酸5mL；

2、 高温高压条件下运行，减少一半消解管寿命，成本极高；

3、 空消之后，还需手工冲洗和干燥，繁琐且二次污染；

4、因脏酸始终在消解管内循环，清洗效果有限。

然而现在使用全自动酸蒸清洗机进行清洗，逐渐被被各大实验室所接受：

1、效率高，一批可处理多达66个55mL消解管；

2、热蒸汽的高效淋洗，一般只需2-5小时，AC400清洗最快只需30分钟；

3、一批只需100-300mL酸；

4、程序控制，清洗重复性好；

5、全自动型号还进行超纯水预清洗。以及在酸蒸清洗之后，自动纯水冲洗和热空气干燥，一条龙式流程。

全自动酸蒸清洗机，解决了痕量分析中样品反应容器的清洗难题，为实验的准确性于便捷性提供助力。喜瓶者，让清洗工作更幸福！

在日常膜片钳实验时，你是否也被这些问题困扰？

操作十分复杂，一不小心就出错

注意事项多，包括如何排除噪音、提高封接成功率等等

想要借鉴该领域专家经验，一直苦寻不到……

8月23日（周二）19：00，「大成学堂」特邀南京大学张洋浔博士做客直播间，为大家带来“膜片钳技术解析与经验分享”。通过本次直播课程，你可以收获膜片钳技术的详细解析、多年实验操作经验、日常操作注意事项等方面的专业知识，还可在线提问获得详细解答。 

张洋浔 博士

南京大学博士，致力于研究内源性神经递质/调质系统及外源性药物对前庭代偿的影响及神经机制，擅长应用全细胞膜片钳记录、环路示踪、光/化学遗传学操控方法、光纤记录等实验技术。相关研究成果发表在Journal of Neuroscience, Biomedicine & Pharmacotherapy, Neuroscience Bulletin等学术期刊。

8月23日（周二）19：00

相约直播间，轻松掌握膜片钳技术

↑↑码上预约，快来免费报名

　　所谓“知己知彼，百战百胜”，对样品的前处理同样的使用。只有选对合适的研磨仪器，才能发挥出其内力，才能磨削出理想的研磨效果。那有关于多样品组织研磨仪的这些奥秘，你都知道吗？

　　多样品组织研磨仪是应用磨模块中的钢珠在惯性力的作用下而对原料产生的高频冲击和摩擦进行的研磨粉碎，而原料磨削的速度很快，可对样品进行混合分散，且不会对试样造成交叉感染的现象。
　　
　　该研磨设备选用高韧性的声卡架，不易变形，工作时的特性相对稳定，在很大程度上提高了样品研磨的细密度。为了避免电流泄漏带来温升产生对样品研磨过程中的影响，通常需要选择超低温预冷的方式进行研磨，并应用缓冲液作为保护。
　　
　　对于样品的超低温预冷，就是要先把样品放在超低温的自然环境中进行一段时间的冷冻存储，通常是应用液氮或者超低温冰箱进行预冷处理，但液氮的预冷速度较快，选择应用的比较广泛。
　　
　　对于多样品研磨仪的样品磨床设计一般是在磨削后的进行的，而手工研磨的却是只需将磨料涂在研磨板上，用手执铸铁件作平行线，进行匀速直线运动或“8字形”的研磨运动，就可将铸铁件调成90°-180°，避免铸铁件扭曲。
　　
　　在每次使用研磨机后，都需要将其研磨垫片取下进行清洗。这样，不仅可以避免研磨垫的破坏，还能够对仪器进行清洗维护，避免研磨液的渗入，对其造成损坏。
　　
　　综上，液氮的超低温预处理给我们样品的研磨造就了一种保护的环境，不仅能够避免电流泄漏温度上升带来的影响还能够使研磨速度加快，而组织研磨仪相对稳定的工作特性更是很我们的样品磨削带来了很大的帮助。

　　湖南省永逸科技有限公司，是2011年1月注册新成立的一家磁测量设备生产和特殊磁场设计的高科技有限公司，于2016年9月迁入湖南省娄底经济技术开发区新合作国际商贸城10楼。

为了更好的使用氮气发生器，在使用前应当检查仪器的进风口是否有杂物堵塞，注意清理，活塞密封圈有一定的寿命，使用完毕后请及时关闭仪器。仪器在使用一段时间后，电解液会逐渐减少，当电解液接近下限时应及时补水，加液时不要超过上限，切勿在未接空气源时空载运行，否则会造成整个仪器报废。如仪器停机一个月或一个月以上时间，请把电解液抽出，仪器如需搬运时，把储液桶中的电解液用吸液管吸干净，然后盖好上盖，以免在运输中残留的电解液外溢，将整个仪器腐蚀，造成无法修复的后果。

氮气发生器常见的小问题如下：

1.运行中出现响声；

解决方法：用扳手对仪器上螺母适当调整松紧度，不要太紧；若不行，需拆开仪器外壳，对内部进行清洗(响主要是因内部有杂质)，若清洗完还不行，须更换新的。

2.在氮气压力达不到设定值时，应首先观察流量表，若流量显示比平时偏大，基本上就可以断定整个体系存在漏气的问题；

解决方法：先关闭电源，卸下气路，氮气出口需要用密封螺帽封紧，然后打开氮气发生器电源，看压力能否达到设定值，并看流量显示能否达到“000”，如果流量显示能回零，说明仪器本身不存在漏气，之后就请检查气体输出口以后的管路，及用气设备是否漏气。若流量显示不能回零，则存在漏气点，请用皂液检查干燥管是否存在漏气现象。

3.运行过程中表头显示数字大压力达不到设定值； 

解决方法：这是漏气造成的，需要对气路进行全mian检漏特别是干燥室及电池。

4.开机无法工作，显示板无显示；

解决方法：先检查电源是否有点，插头等是否插好，然后再检查保险是否完好，仪器显示板排线插件是否插好。保险位于仪器后面电线插座内，用小“一”字改锥或尖的金属工具向外撬即可取出，看仪器内电路板指示灯是否亮，若不亮，检查电路板上保险是否烧掉，若烧掉须换保险3A，换后仍不显示，须换电源。

5.开机显示“000”；

解决方法：检查仪器后空气输入端是否有气体输入。

6.开机10分钟后显示数字有但不升压，无气体输出；

解决方法：检查插件是否脱落松动，用表对插件进行测量，若没有220V电压，需更换电源。

7.仪器开机时即有气体输出；

解决方法：在刚开机压力上升时，需要按下延时开关。然后在输出压力从输出端放出10分钟后继续使用。

8.输出的氮气不纯；

解决方法：检查电解液浓度是否过低，空气压力与空气源压力差是否过小。

一篇在线发表于《细胞》杂志的论文介绍了一项重要突破：来自韩国的研究团队***在线粒体DNA中实现A碱基到G碱基的转换，为基因编辑技术填补上一块***关重要的拼图，也带来了治愈多种线粒体遗传病的希望。

从上世纪60年代***发现***性内切酶，到1985年发明PCR技术，再到***近十年CRISPR技术诞生、用于活体生物的基因编辑，短短半个世纪，人类在一次又一次的突破中实现了操纵DNA能力的巨大飞跃。其中，CRISPR的出现更是让科学家能高效编辑基因组中的致病突变，为众多遗传病提供全新的方案。

不过，还有一朵乌云长期笼罩在基因编辑领域的上空，这就是线粒体DNA的编辑。

作为参与能量代谢的重要细胞器，线粒体中也含有少量来自母系的DNA。如果这部分基因发生突变，则可能导致多种与代谢相关的遗传疾病。

例如，Leber遗传性视神经病变（LHON）可能导致患者失明，这种凶险的疾病就是由线粒体DNA的点突变导致的。线粒体DNA突变还可能导致某些线粒体脑肌病，患者的大脑遭受损伤，可能出现癫痫、精神行为异常等症状。平均每5000个人里，就有一个人患上线粒体点突变导致的遗传病。

尽管基因编辑工具***近十年迎来爆发式发展，但面对线粒体遗传病时，这些工具却总是难以奏效。例如，当下***为盛行的CRISPR-Cas系统就因为向导RNA不能穿越线粒体膜，因而无法用于线粒体疾病。

线粒体DNA的编辑，可以说是基因编辑领域***后一块未经涉足的土地，而这个难题也成为治愈多种遗传疾病必须跨越的障碍。

2020年，一项***性的突破到来。Broad研究所的刘如谦教授团队开发了一款名为DdCBE的基因编辑工具，可以直接修改双链DNA上的碱基，实现从C碱基到T碱基的转换，这也是科学家***在人体细胞中进行线粒体DNA的编辑。

不过，作为线粒体DNA编辑的开拓性成果，DaCBE也有不足之处：其只能高效地进行TC-TT序列的转换，在90个已知的致病线粒体突变位点中，只有9个能得到修复。

而在这90个突变位点中，有多达39个都可以通过A-G碱基的转换来修复。如果能找到实现A-G转换的手段，那么包括上述两种疾病在内，多种线粒体遗传病都有望迎来治愈的方法。

在这项发表于《细胞》的***新研究中，来自韩国基础科学研究所基因编辑中心的研究团队终于完成了这项“不可能的任务”，他们开发出一款全新的基因编辑平台，命名为转录激活因子样效应物相关脱氢酶（transcription activator-like effector-linked deaminases，简称TALED）。

▲TALED编辑线粒体DNA的示意图

论文***作者CHO Sung-Ik表示：“我们设计的新型碱基编辑器极大地拓展了线粒体DNA编辑的范围，这不仅有助于构建疾病模型，还将帮助人们开发新疗法。”

TALED到底是什么？接下来我们将看到，TALED由3个功能各异的主要部分组成，它们环环相扣、共同协作，***终完成这项基因编辑任务。

***个部分，可以看作TALED的向导。前面说到，常见的基因编辑系统无法进入线粒体。为了解决这个问题，TALED与刘如谦团队开发的DaCBE一样，使用了转录激活因子样效应物（TALE）。作为一种DNA结合蛋白，TALE蛋白能够靶向特异的DNA序列，其在线粒体靶向序列（MTS）的引导下进入线粒体，并且与特定的线粒体DNA序列结合。

到这里，TALED就被带到了工作场所。在这里，轮到TALED的第二个部分登场。研究团队需要找到合适的脱氢酶，在这里实现A-G碱基的转换。为此，他们选择是名为TadA8e的腺嘌呤脱氢酶，其由大肠杆菌的腺嘌呤脱氢酶改造而来。

这个选择颇具创意，因为TadA8e被认为是一种专门对单链DNA起作用的蛋白，但在这里，它需要在线粒体的双链DNA中进行碱基编辑。

这篇论文的通讯作者，基因编辑中心主任KIM Jin-Soo教授说：“没有人想过用TadA8e在线粒体中进行碱基编辑，因为它被认为只对单链DNA起作用。正是这个跳出传统框架的想法，帮助我们发明了TALED。”

而帮助TadA8e做到这一点的，是TALED的***后一个主要部分：胞嘧啶脱氢酶DddAtox。DddAtox使得双链DNA可以短暂地解开，而TadA8e正是抓住了这个转瞬即逝的时间窗口，在人类细胞的线粒体中高效催化A-G碱基的转换，编辑频率可高达49%。

▲TALED实现了A-G碱基的转换

通过对TALED的调整，研究团队分别开发出能同时实现A-G以及C-T碱基转换的技术，以及仅进行A-G转换的技术。

当然，作为一项开创性的技术，TALED仍有不***之处，例如在进行碱基编辑时，可能会造成与目标位点相邻的核苷酸也发生转换；此外，TALED是否会在哺乳动物细胞中产生脱靶效应也有待观察。

但毫无疑问，TALED技术的出现让我们又多了一种***潜力的基因编辑工具，展望这项技术的未来应用场景，研究团队希望能提升TALED的编辑效率与特异性，***终能够分别在胚胎、新生儿与成年患者体内修正致病的线粒体突变。我们期待，那些受困于线粒体遗传病的人们终将迎来治愈的一刻。

RNA提取磁珠属于纳米生物磁珠的一种，主要作用是用于核酸提取过程中的RNA提取，粒径分布在500nm左右，是洛阳吉恩特生物自主研发生产的高分子纳米磁性微球，该磁珠悬浮时间长，磁响应时间迅速，对DNA甲基化过程中的提取环节提供良好的支持，可明显缩短实验时间，提高实验效率，并在提取结果上保持稳定，配合核酸提取仪，更能实现快速的RNA提取。

分析与表征：新型聚合物递送载体有望解决后眼部给药的递送难题

Intravitreal Polymeric Nanocarriers with Long Ocular Retention and Targeted Delivery to the Retina and Optic Nerve Head Region

视网膜等后眼部组织在许多严重的眼部疾病中会受到影响，由于眼部结构是非常复杂的，所以是否可以成功地将治 疗药物递送至视网膜等后眼部组织具有极大的挑战性，其中玻璃体腔内注射法是常用方式之一，但该方式需要延长注射的间隔时间。研究人员使用聚乙二醇、聚己内酯和碳酸三亚甲基酯合成三嵌段共聚物，并使用1H-NMR和凝胶渗透色谱法GPC对聚合物的结构进行表征。研究表明：该聚合物可自组装成聚合物泡囊和聚合物胶束。通过动态光散射DLS对其尺寸进行表征，平均直径分别约为100nm和30–50nm。基于单颗粒追踪和非对称流场分离技术，聚合物胶束和聚合物泡囊在玻璃体中可扩散且稳定存在。在Alamar Blue测定中，这些材料在人工培养的人脐静脉内皮细胞中均未显示细胞毒性，使用体内荧光光度法评估玻璃体内纳米载体在兔体内的药代动力学，聚合物泡囊（100nm）和胶束（30nm）的半衰期分别为11.4-32.7天和4.3-9.5天，聚合物泡囊和聚合物胶束的玻璃体内清除值分别为1.7–8.7µL/h和3.6–5.4µL/h。颗粒在兔玻璃体中的表观体积分布对于聚合物胶束为0.6-1.3ml，对于聚合物泡囊为1.9-3.4ml。给药至少92天后仍可在玻璃体中发现聚合物泡囊，此外，眼底成像显示，聚合物泡囊聚集在视神经附近，并且在注射后111天仍然存留在那里。因此聚合物泡囊用于后眼部进行可控和特定位点的药物递送是一种十分具有发展前景的技术。