科学家开发重量级基因编辑工具

一篇在线发表于《细胞》杂志的论文介绍了一项重要突破：来自韩国的研究团队***在线粒体DNA中实现A碱基到G碱基的转换，为基因编辑技术填补上一块***关重要的拼图，也带来了治愈多种线粒体遗传病的希望。

从上世纪60年代***发现***性内切酶，到1985年发明PCR技术，再到***近十年CRISPR技术诞生、用于活体生物的基因编辑，短短半个世纪，人类在一次又一次的突破中实现了操纵DNA能力的巨大飞跃。其中，CRISPR的出现更是让科学家能高效编辑基因组中的致病突变，为众多遗传病提供全新的方案。

不过，还有一朵乌云长期笼罩在基因编辑领域的上空，这就是线粒体DNA的编辑。

作为参与能量代谢的重要细胞器，线粒体中也含有少量来自母系的DNA。如果这部分基因发生突变，则可能导致多种与代谢相关的遗传疾病。

例如，Leber遗传性视神经病变（LHON）可能导致患者失明，这种凶险的疾病就是由线粒体DNA的点突变导致的。线粒体DNA突变还可能导致某些线粒体脑肌病，患者的大脑遭受损伤，可能出现癫痫、精神行为异常等症状。平均每5000个人里，就有一个人患上线粒体点突变导致的遗传病。

尽管基因编辑工具***近十年迎来爆发式发展，但面对线粒体遗传病时，这些工具却总是难以奏效。例如，当下***为盛行的CRISPR-Cas系统就因为向导RNA不能穿越线粒体膜，因而无法用于线粒体疾病。

线粒体DNA的编辑，可以说是基因编辑领域***后一块未经涉足的土地，而这个难题也成为治愈多种遗传疾病必须跨越的障碍。

2020年，一项***性的突破到来。Broad研究所的刘如谦教授团队开发了一款名为DdCBE的基因编辑工具，可以直接修改双链DNA上的碱基，实现从C碱基到T碱基的转换，这也是科学家***在人体细胞中进行线粒体DNA的编辑。

不过，作为线粒体DNA编辑的开拓性成果，DaCBE也有不足之处：其只能高效地进行TC-TT序列的转换，在90个已知的致病线粒体突变位点中，只有9个能得到修复。

而在这90个突变位点中，有多达39个都可以通过A-G碱基的转换来修复。如果能找到实现A-G转换的手段，那么包括上述两种疾病在内，多种线粒体遗传病都有望迎来治愈的方法。

在这项发表于《细胞》的***新研究中，来自韩国基础科学研究所基因编辑中心的研究团队终于完成了这项“不可能的任务”，他们开发出一款全新的基因编辑平台，命名为转录激活因子样效应物相关脱氢酶（transcription activator-like effector-linked deaminases，简称TALED）。

▲TALED编辑线粒体DNA的示意图

论文***作者CHO Sung-Ik表示：“我们设计的新型碱基编辑器极大地拓展了线粒体DNA编辑的范围，这不仅有助于构建疾病模型，还将帮助人们开发新疗法。”

TALED到底是什么？接下来我们将看到，TALED由3个功能各异的主要部分组成，它们环环相扣、共同协作，***终完成这项基因编辑任务。

***个部分，可以看作TALED的向导。前面说到，常见的基因编辑系统无法进入线粒体。为了解决这个问题，TALED与刘如谦团队开发的DaCBE一样，使用了转录激活因子样效应物（TALE）。作为一种DNA结合蛋白，TALE蛋白能够靶向特异的DNA序列，其在线粒体靶向序列（MTS）的引导下进入线粒体，并且与特定的线粒体DNA序列结合。

到这里，TALED就被带到了工作场所。在这里，轮到TALED的第二个部分登场。研究团队需要找到合适的脱氢酶，在这里实现A-G碱基的转换。为此，他们选择是名为TadA8e的腺嘌呤脱氢酶，其由大肠杆菌的腺嘌呤脱氢酶改造而来。

这个选择颇具创意，因为TadA8e被认为是一种专门对单链DNA起作用的蛋白，但在这里，它需要在线粒体的双链DNA中进行碱基编辑。

这篇论文的通讯作者，基因编辑中心主任KIM Jin-Soo教授说：“没有人想过用TadA8e在线粒体中进行碱基编辑，因为它被认为只对单链DNA起作用。正是这个跳出传统框架的想法，帮助我们发明了TALED。”

而帮助TadA8e做到这一点的，是TALED的***后一个主要部分：胞嘧啶脱氢酶DddAtox。DddAtox使得双链DNA可以短暂地解开，而TadA8e正是抓住了这个转瞬即逝的时间窗口，在人类细胞的线粒体中高效催化A-G碱基的转换，编辑频率可高达49%。

▲TALED实现了A-G碱基的转换

通过对TALED的调整，研究团队分别开发出能同时实现A-G以及C-T碱基转换的技术，以及仅进行A-G转换的技术。

当然，作为一项开创性的技术，TALED仍有不***之处，例如在进行碱基编辑时，可能会造成与目标位点相邻的核苷酸也发生转换；此外，TALED是否会在哺乳动物细胞中产生脱靶效应也有待观察。

但毫无疑问，TALED技术的出现让我们又多了一种***潜力的基因编辑工具，展望这项技术的未来应用场景，研究团队希望能提升TALED的编辑效率与特异性，***终能够分别在胚胎、新生儿与成年患者体内修正致病的线粒体突变。我们期待，那些受困于线粒体遗传病的人们终将迎来治愈的一刻。

RNA提取磁珠属于纳米生物磁珠的一种，主要作用是用于核酸提取过程中的RNA提取，粒径分布在500nm左右，是洛阳吉恩特生物自主研发生产的高分子纳米磁性微球，该磁珠悬浮时间长，磁响应时间迅速，对DNA甲基化过程中的提取环节提供良好的支持，可明显缩短实验时间，提高实验效率，并在提取结果上保持稳定，配合核酸提取仪，更能实现快速的RNA提取。

哈佛大学的科学家已经造出了这种神奇的食品包装涂层。在一项发表于《自然•食品》的研究中，作者展示了如何利用天然材料实现食品包装的***。

目前的塑料食品包装需要消耗大量石油，并且难以降解。因此，研究团队希望开发出一款更具可持续性、可降解并且无毒性的替代材料。这项研究的Philip Demokritou教授说：“同时我们也在问自己，我们能不能设计出能延长生鲜食品销售时间、减少食物浪费并且提升食品安全的新型包装。”

这款新型材料的主体成分，是由普鲁兰多糖——一种由微生物天然发酵形成的多糖——构成的纤维结构。这种多糖被FDA认定为“通常被认为是安全的”（GRAS）成分。此外，纤维结构中还添加了天然抗jun成分，包括百里香精油、柠檬酸和乳酸链球菌肽。

相比于现有的食品膜，纤维结构材料的表面积/体积比更高，因此携带的成分可以更高效地发挥作用，以更低的成本解决病原体污染食品的问题。

为了让材料附着在食物表面，研究团队开发出一套高通量的喷涂设备：以水为溶剂，直接喷涂***新鲜食物的表面，形成纤维保护层。

▲这套设备能将涂层均匀喷涂***食品表面

尽管看起来只是涂了一层膜，但这层材料足够结实，可以避免运输途中的磕伤；同时，材料包含的抗菌成分可以抵御大肠杆菌、李斯特菌等常见病原体。

以牛油果为例，研究团队检验了这种材料的效果。牛油果在运输途中仍会持续成熟，并且可能腐烂，因此有利于看清食品的保存情况。

经过2~4分钟的喷涂，牛油果被纤维涂层包裹。这时，牛油果的可销售时间延长了50%。相比于对照组，它们的腐烂比例更低、菌群数量与质量损失更少。而去除这层材料也很容易，只要水洗20秒就可以冲去，在土壤中仅需3天也可以降解。

▲对照实验展示了涂层良好的保鲜效果

Demokritou教授道：“我们提出的是一项可规模化的技术，它可以让我们将生物聚合物转变为能够直接包裹食物的纤维。这将成为新一代更智能、绿色的食品包装。”此外，研究团队还通过实验展示了大规模生产这款材料的潜力。

Demokritou教授说：“在过去五六十年间，我们已经向环境排放了600万吨塑料垃圾。它们的降解十分缓慢，而降解产生的微小颗粒也会随着饮用水、食物甚***是空气进入我们体内。”而研究团队制造的智能纤维材料能消除菌株，确保食物的安全。这款全新设计的材料，或许将改变现有的食物存储模式，引领下一场***。

11月19日北京时间23:00（巴黎时间：17:00），欧洲分子生物学实验室研究员Moritz Kueblbeck将于Genomeweb平台在线分享“在CRISPR编辑的细胞系中使用数字PCR进行标记拷贝数评估”相关知识。

本网络研讨会将介绍如何使用dPCR快速定量CRISPR编辑的HeLa细胞中的绿色荧光蛋白拷贝数。讨论还将介绍dPCR的工作原理和采集后的数据分析方法。

Moritz Kueblbeck在德国海德堡的癌症研究ZX(DKFZ)做了八年的研究员。2014年,他加入了Jan Ellenberg在海德堡的欧洲分子生物学实验室,在不同实验室的项目中，他使用CRISPR/Cas9方法利用内源性的标记蛋白(在HeLa和U-2 OS细胞进行不同标签的纯合敲入)进行人类细胞系基因组编辑。

内容简介

l  荧光蛋白或自标记是使用荧光显微镜研究活细胞中蛋白质动力学的宝贵工具。然而，定量成像需要目标蛋白(POI)的生理表达水平，特别是当需要研究POI的化学计量相互作用时。

l  CRISPR使研究人员能够标记几乎任何感兴趣的目标基因，使其可以研究相应POI的生理表达水平。然而，正确编辑细胞克隆的产生和选择——即标记等位基因的预期数量和缺乏额外的整合——需要对标记的拷贝数进行定量评估。

l  探讨dPCR是一种快速、可靠的荧光标记CRISPR编辑细胞定量检测方法。

注册地址：https://event.on24.com/eventRegistration/EventLobbyServlet?target=reg20.jsp&partnerref=stilla&eventid=2111188&sessionid=1&key=2206BD6DA2548F0F9C46911E3A71DD

[主题]

    FluidFM：CRISPR基因编辑技术的新突破

[直播时间]

    2020年3月26日，16:00 - 17:00

[报告简介]

    提高转染物质导入细胞核的效率目前仍然是基因编辑中的一大挑战。FluidFM 技术能够将转染物质直接注射到细胞核中，从根本上解决这一难题。这一技术对于极难转染或原代的细胞系的基因编辑有着十分重要的意义。

    本次研讨会是关于“提高CRISPR基因编辑效率的全新方法”的网络研讨会。向您展示如何通过直接向细胞核中导入转染物质，从而解决细胞转染效率低下的问题。

特别提示：本次研讨会还包括在线的实验演示！

[产品简介]

    瑞士Cytosurge公司多功能单细胞显微操作系统—FluidFM BOT，是将原子力系统、微流控系统、细胞培养系统为一体的单细胞操作系统。主要功能包括单细胞注射、单细胞提取以及单细胞分离。

    FluidFM BOT打开了传统单细胞实验手段无法触及领域的大门。突破了单细胞研究、药物开发、细胞系开发中的障碍，让细胞膜不再成为阻碍单细胞研究的壁垒。

    多功能单细胞显微操作系统FluidFM BOT浓缩了FluidFM科技的全部精华，尤其是在自动化程度和操作速度上的提高。它不仅保留了产品在生物学上的能力。更能够将这些功能进行组合来创造更加GX、便捷全新试验方法。

[注册报名]

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[联系方式]             

[主办方]

       荣登封面的这项研究成果来自哈佛***神经科学家Joshua Sanes教授领衔的科学家团队。研究人员采用高通量单细胞基因测序的方法，创建了灵长类动物的视网膜细胞型态分类图谱，揭示为我们带来敏锐视觉的细胞有哪些特殊的基因特征。这项研究同时为理解人类视觉在疾病情况下如何被破坏提供了重要的基础。

      凹：让我们看得清清楚楚明明白白真真切切

人类的视觉在哺乳动物中出类拔萃，比如我们能够阅读，分辨人脸。这些功能可不简单，需要视觉能够分辨极细微的差异，并能迅速对焦。高清视觉全得归功于视网膜中间一个极小的特殊区域——***凹，也就是眼底黄斑的中心。凹的直径不到1.5毫米，面积只占视网膜的不到1%，但大脑获得的视觉信息却有50%来自这里。

     凹的特殊，还不仅是因为视线的“焦点”落在此处提供清晰影像，要知道哺乳动物中只有部分灵长类生物进化出了这个结构，比如人类。

▲“那（fovea）是个稀罕物，岂是什么生物都能有的？”

      凹为人类提供了视力的同时，却让科学家在解决人类视觉疾病时面临一个难题。就拿实验“劳模”小鼠来说，虽然它们为人类的科学研究提供了无数疾病模型，但它们“鼠目寸光”，视网膜没有***凹！这种 “先天缺陷”让它们在视觉相关疾病的模型上帮不上什么忙。再加上***凹结构太微小了，过去科学家在灵长类动物上的研究也止于形态解剖学的描述。

     终，他们在凹和外周视网膜中均鉴定出了近70种不同类型的细胞，并且还知道了每一个类型的细胞表达哪些基因。

      详尽的细胞分类图谱给科学家们提供了许多过去不知道的信息。用Sanes教授的话说，“我们现在弄清楚了凹特别在哪里。”

▲凹的细胞和外周视网膜类型相似，但组成却不同 

       尽管细胞类型九成相同，但***凹和外周视网膜的细胞类型组成不同。更关键的是，在同类型的细胞中，***凹处的细胞检测到表达与外周不一样的基因。非常有意思的是，这些基因的表达和***凹独特的视觉信息处理极为相关，科学家们相信，可能这才是***凹功能特殊的原因。

       核酸提取产品对细胞筛选的方法已日渐成熟，原理是将包被一抗的磁珠与细胞表面对应的分子特异性结合，或者将包被二抗的磁珠与已经与细胞表面分子特异性结合的一抗结合。核酸提取磁珠携带与之结合的细胞吸附与分离柱或试管上，实现阳性细胞或阴性细胞的分离。洛阳吉恩特生物自主研发生产了各类核酸提取磁珠，可以实现稳定的实验结果。

ETAS软件产品：RTA_用于ECU代码开发

RTA产品系列包括RTA-OSEK， RTA-OS，RTA-RTE， RTA-TRACE以及相关的附加软件。它们组成了一个完整的开发工具包，用于ECU代码开发。

RTA-OSEK

RTA-OSEK可提供符合AUTOSAR-OS V1.0（SC-1）和OSEK-OS V2.2.3要求的解决方案，由以下工具及模块组成：

Planner

建造应用程序的时间模型并采用先进的时限单调性分析（Deadline Monotonic Analysis）法证明在运行时能够满足其所有的性能约束，并将解决问题所需的成本控制在Z小范围之内。  

Builder

自动为应用程序中的各个任务和ISR（中断服务程序）生成经过优化的头文件以及OS数据结构。利用静态配置，可生成内存使用量Z小的数据结构，并可使用快速API调用来减小CPU的占用。

产品软件模块

在采用AUTOSAR-OS和OSEK-OS标准方面处于行业lingxian地位。它支持很多微控制器及编译器，各个端口都单独通过了认证，确保了它们的兼容性。它还符合MISRA C标准的要求，确保可安全地进行嵌入式操作。 

RTA-OSEK可生成所有所需的测量模块接口配置，使用户可通过RTA-TRACE观察应用程序的运行情况。 

RTA-OS3.0

RTA-OS3.0是一种实时操作系统，其适用于汽车ECU设计所有领域的应用。它同时满足AUTOSAR R3.0 OS以及OSEK/VDX OS V2.2.3标准，且与MISRA C完全兼容。

RTA-RTE

RTA-RTE3.0是一种成熟且已量产的高质量AUTOSAR运行环境（RTE）生成器，它符合AUTOSAR Release 3.0。

RTA-TRACE

RTA-TRACE通过以下功能提高调试速度：  

时间跟踪

实时观察应用程序的运行情况，与软件逻辑分析器的功能完全相同。

统计插入

自动计算系统中每个任务执行时间的各种统计数据。

ECU连接

设备驱动器和DLL可将ECU中的数据传输到RTA-TRACE PC、CAN、调试器及串行联接中。ECU连接端口包使用户可根据需要创建定制式的连接。

RTA-TCEL

RTA-TCEL提供了一种使用ES580通过CAN总线从目标ECU向电脑主机传输数据的方法。

RTA-OSEK

RTA-OSEK具有一个适用于汽车ECU设计所有领域的生产型实时操作系统。它同时采用了 AUTOSAR-OS SC1和OSEK/VDX OS V2.2.3标准，并完全符合MISRA C的要求。它具有一个尺寸极小而且运行速度极快的内核，该内核适用于20多种微控制器。RTA-OSEK还结合了可用于对操作系统进行配置和分析的Planner和Builder工具。

Planner工具可针对应用程序的实时时限建立模型并可提前预测该应用程序的实时运行情况。Builder工具可用来生成该应用程序的优化数据结构和代码。RTA-OSEK部件库具有用于RTA-TRACE的可配置测量仪器。这样，用户便可使用功能强大且GX的开发程序来进行实时应用程序的开发。

RTA-OSEK 具有系统资源占用低和先进的时间安排控制功能等特性，是动力总成系统及底盘电子应用中的理想产品。车身电子模块的设计者们非常看重这种极低的内存使用量及堆栈优化功能。同时，RTA-OSEK可进行广泛的一致性检查，并可自动生成设计检查表和模板文件，因而十分有助于ECU软件开发者们的开发工作。
RTA-OSEK在PC端口上也适用。这为AUTOSAR的虚拟开发和基于ECU应用软件的OSEC提供支持。例如，您可在您的电脑而不是产品硬件上进行开发。

功能一览:

◆采用AUTOSAR-OS SC1标准  

◆通过OSEK/VDX OS标准所有等级要求的认证

◆符合MISRA C要求  

◆支持8、16及32位微控制器

◆支持在标准Windows电脑上虚拟ECU的开发

◆低CPU占用

◆内存要求小

◆系统时间可调度性（schedulability）、灵敏度、堆栈容量及Z小CPU速度分析

◆可自动生成优化的数据结构  

◆方便使用的图形界面 

◆独特的单堆栈实现（ZL申请中），通常可节省50-80%的应用程序存储空间

RTA-OS

RTA-OS3.0是一种实时操作系统，其适用于汽车ECU设计所有领域的应用。它同时满足AUTOSAR R3.0 OS以及OSEK/VDX OS V2.2.3标准，且与MISRA C完全兼容。

       RTA-OS3.0采用了行业内lingxian的RTA-OSEK嵌入式技术。秉承minimum的运行时间耗费以及灵活配置的原则，RTA-OS3.0能为您的应用软件生成Z优化的OS内核。由于AUTOSAR OS具备充分的接口，包括时序和存储器保护，所以OS配置和生成工具就必须将OS对整个系统所产生的影响Z小化。通过其创新的OS生成方式，RTA-OS3.0可以非常简单地接至通用的汽车微控制器和编译器上。ETAS对汽车应用软件的嵌入式软件的需求有着深入的了解，而RTA-OS3.0就是专为新一代的AUTOSAR系统而开发的。

RTA-OS3.0可以与其他ETAS的软件工程工具进行无缝整合；它与RTA-RTE（ETAS提供的AUTOSAR运行时环境生成器）完全兼容。此外，RTA-OS3.0还完全支持RTA-TRACE；这就让您可以使用RTA-TRACE强大的可视化能力来对您应用软件的性能进行分析和测量。

为了支持AUTOSAR应用软件的虚拟开发，RTA-OS3.0将在一台装有Windows的个人电脑上进行编译和执行的能力作为标准。这一强大的特性使您可以看到您应用软件中新想法的结果，而不受ECU目标硬件的影响。RTA-OS3.0可以安装在您桌面上开始创建AUTOSAR应用程序所需的所有开发工具。

功能概览：

◆AUTOSAR R3.0 OS标准的工具

◆OSEK/VDX OS标准的所有匹配等级的认证工具

◆与MISRA C相匹配的工具

◆支持8位、16位以及32位的微控制器

◆支持基于标准Windows电脑的虚拟ECU开发

◆很少的CPU开销

◆需要很少的内存

◆分析系统的可调度性、敏感性、堆栈大小以及minimumCPU运算速度

◆自动生成Z优数据结构

◆图形接口易于使用

◆独特的单堆栈实现工具，其通过适合的OS配置，一般可节省50%到80%的应用软件占用空间

RTA-OSEK

AUTOSAR运行环境（RTE）实现了应用软件组件的通讯基础构架、应用软件组件的实时调度以及应用软件组件与基本软件模块之间的接口。RTA-RTE3.0是一种成熟且已量产的高质量AUTOSAR运行环境（RTE）生成器，它符合AUTOSAR Release 3.0。它是一种基于个人电脑的命令行工具，可以简单的集成到各种建立环境中，以生成与AUTOSAR兼容的RTE。RTA-RTE产品线还包括了符合AUTOSAR Release 2.0的RTA-RTE2.0。RTA-RTE3.0帮助客户解决许多涉及RTE生成过程的问题，例如，提供输入XML配置信息的验证、生成操作系统（OS）配置信息以及提供简单的查错能力。RTA-RTE3.0的另一个重要特征是，系统能够在可能的时候对生成RTE的资源使用量进行优化，便于用户作决定：应该优化代码大小（内存）还是该优化运行时间（CPU占用量）。RTA-RTE3.0生成的RTE独立于编译器和目标，使其可以在广泛的ECU平台上使用。

功能概览:

◆成熟的RTE生成工具

◆符合AUTOSAR Release 3.0

◆ 所生成的RTE对MISRA C完全兼容

◆与 RTA-OSEK 以及RTA-OS3.0的无缝整合

◆可以针对内存或CPU占用率，对RTE资源的使用量进行优化

◆可以非常简便得与各种建立环境集成

◆验证输入数据（XML）的正确性和一致性

◆既支持AUTOSAR合同阶段，也支持RTE生成阶段

◆输出OS配置，使RTE和OS的整合变得简单

◆独立于编译器和目标的RTE可以在广泛的ECU平台上使用

◆支持用C或C++编写的SWCs，这些语言可作为源代码或者是主体代码

◆通过使用虚拟功能总线（VFB）来进行跟踪，使查错变得很简单

◆ 生成的RTE与OSEK 2.2.3、AUTOSAR兼容

◆SC1及ERCOSEK V4.3操作系统

RTA-TRACE

LiveDevices软件逻辑分析仪使用户能够：

◆通过复杂应用程序运行情况的图形显示，加快调试过程。

◆借助于内部操作系统（OS）事件的可视化来加强对应用程序的控制并提高可信度。

◆借助于报告模块，可轻松形成系统特性文档。

◆通过详细的统计分析，改善系统及模块的验证。

◆OS仪器包可灵活用于任何基于OSEK-OS、非OSEK-OS或调度程序的应用程序。

◆支持多种标准ECU连接及灵活的ECU目标连接组件，可方便地集成到任何开发环境中。 

RTA-TRACE是LiveDevices的一种新型跟踪工具，使实时嵌入式软件的开发更加简单明了。通过RTA-TRACE，用户可查看某个系统中复杂的实时交互作用， 从而更快地发现问题并加快软件开发速度。RTA-TRACE可向开发者提供一个观察应用程序运行情况的窗口。开发者可从正在运行的应用程序中捕获跟踪数据，以清晰的格式将其显示出来，再快速对其进行解释，从而可快速识别出缺陷并加以消除。

借助于RTA-TRACE，开发者可在与应用程序开发所采用的相同的抽象层上进行开发工作；RTA-TRACE 可显示由开发者创建的应用程序的特征数据 ，与使用C语言调试器作为基于OS的应用程序代码调试工具相比，这种方法向前迈进了一大步。RTA-TRACE可帮助用户快速而GX地解决以下问题： 

◆任务/中断程序的Z短、Z长及平均执行时间是多少？

◆任务/中断信号激活速率的抖动（jitter）是什么?

◆在运行时会出现什么样的抢占（preemption）模式？

◆源/旗语（resource/semaphore）的使用是否会引起性能故障？

◆总CPU利用率是多少？

RTA-TRACE工具可在PC上运行并显示从目标ECU上捕获的跟踪数据。应用程序中的相关测量接口配置（可记录OS及用户级事件数据）可将跟踪数据存储在目标ECU的跟踪缓冲器中。使用OS工具包（RTA-TRACE的组成部分），用户可配置市场上的各种OSEK-OS (LiveDevices的另一种服务)。此外，该工具包还可用于向任何自主开发的操作系统或循环应用增加测量设备，这样便可通过RTA-TRACE工具捕获并分析跟踪数据。

跟踪数据通过ECU连接传输给主机系统。RTA-TRACE可用串行和基于调试器的方法进行ECU连接（可提供可选附加产品即基于CAN总线的ECU连接，RTA-TCEL）。RTA-TRACE 中的ECU连接端口组件使用户可为其它物理层传输路径开发出更多的ECU连接。

RTA-TCEL

       RTA-TCEL（Trace CAN ECU Link）是RTA-TRACE调试和分析工具的一个附件产品。RTA-TCEL提供了一种使用ES580通过CAN总线从目标ECU向电脑主机传输数据的方法。
       RTA-TCEL支持附带TouCAN控制器的MPC56x。同时，它还提供一个全功能接口工具包，以满足开发人员连接RTA-TCEL和其它微处理器及CAN控制器的需求。
       RTA-TCEL可被用于具有通过控制器系统中单独的CAN通道来通信；也可以与标定用的CAN总线进行共享来发送跟踪数据（文档中提供示意图来解释如何和现有的CAN网络软件一起使用RTA-TCEL）。
       功能概览:
       ◆从ECU到主机的高带宽跟踪数据传输
       ◆独立或并行的标定CAN通讯流量
       ◆支持ES580 CAN总线以及LIN总线PCMCIA卡

CRISPR-Cas9技术彻底改变了基础生物研究和应用生物技术的许多领域。但在临床基因治疗实施中脱靶效应的检测仍然存在难题。德国汉堡大学-艾本多夫医学中心（UKE）干细胞移植、细胞和基因治疗研究所的学者们近日在知名杂志《Molecular Therapy》上发表“LATE–a novel sensitive cell-based assay for the study of CRISPR/Cas9-related long-term adverse treatment effects”的文章，建立了称为LATE（长期不良治疗效果鉴定检测）的新型检测方法，该方法使用Stilla naica®微滴芯片数字PCR系统检测低频的脱靶事件，且有助于分析Cas9脱靶切割效应的影响，并可在单细胞层面进行评估。

为了证明LATE方法有助于检测Cas9脱靶切割后的功能影响，研究人员进行了小规模的原理验证实验：明星基因TP53基因敲除后会导致细胞表现出相对生长优势，这是主要的致瘤性标志之一，因此可以作为验证“LATE”检测脱靶能力的指示。本文选取TP53进行CRISPR靶向实验，并转染到有限稀释后的原代人类新生儿包皮成纤维NUFF细胞中，通过“LATE”方法重复检测到低频(<0.5%)生长促进事件，这一结果证明了即使在低起始细胞数的情况下，LATE检测也具有高灵敏度，并且可以对单个细胞进行评估。

图 1. LATE检测原理

LATE检测的原理包括 (1)用编码荧光蛋白、设计的核酸酶(Cas9)和gRNA的慢病毒载体转导原代人类新生儿包皮成纤维细胞 (NUFF)，(2) 使用流式细胞术分析转导率并连续监控长达10周，(3)读取结果，随着转导细胞数量的增加，作为基因组编辑效应的细胞获得生长优势

在这一过程中，“LATE”读取到的阳性结果（获得生长优势的细胞）会不会由TP53以外的基因被“脱靶敲除”引起，或者是序列存在其他的突变，例如插入诱变从而导致细胞获得生长优势呢?为了研究“LATE”检测的阳性结果与TP53插入缺失之间的联系，研究人员设计了GEF-dPCR（gene-editing frequency digital PCR）实验，即Drop-Off分析方法，该方法可以量化gRNA结合位点以及脱靶位点的插入缺失频率。

图2. NUFF细胞获得的生长优势与TP53中的插入/缺失频率相关 (A)TP53外显子4片段和GEF-dPCR中使用的FAM、HEX标记探针的示意图。(B) TP53插入/缺失频率，数据由GFR-dPCR测量获得。(C) 脱靶TP53插入/缺失频率，由GEF-dPCR测量获得。

对于TP53 gRNA结合位点的检测，GEF-dPCR使用两个双标记水解探针，一个HEX标记探针与远离gRNA识别序列的区域结合，易发生插入缺失的位点设计FAM标记的探针（图2A）。

文中使用Stilla naica®微滴芯片数字PCR系统进行GFR-dPCR方法检测，实验方法详见原文第12页。

随后进行Stilla naica®微滴芯片数字PCR系统检测，结果显示随着时间的推移，TP53插入缺失的频率随之增加，转导后第7天插入缺失率为1%–22%，在52天后达到44%–85%的峰值，该变化趋势和细胞获得生长优势的趋势一致。（图2B）

研究人员还对TP53脱靶位点的插入缺失频率进行了检测（图2C）。上述dPCR检测结果也与NGS测序方法和RGB荧光标记方法一致，从而说明“LATE”能够检测TP53介导的gRNA的不良脱靶效应，但这些gRNA并没有被常用的在线预测工具标记为“危险信号”。

随后，作者还验证了“LATE”可用于任何类型的设计核酸酶以及不同的CRISPR/Cas变体，并且可以扩展用于其他细胞类型，尤其是高度相关的原代hMSC。因此，“LATE”实验方案可用于验证特定细胞类型中特定设计核酸酶的脱靶效应的影响。

图3：LATE检测可应用于hMSCs和h-TERT永生化细胞

综上，“LATE”可以作为一种简单、快速和经济的技术手段，用来评估CRISPR/Cas系统带来的生理“副作用”影响，辅助临床前的安全性研究，是对基于NGS的全基因组脱靶检测方法的有效补充，特别是补充了流式和数字PCR的检测结果。

期刊介绍：《Molecular Therapy》是美国基因治疗学会(ASGT)的月刊，是基因转导、载体开发与设计、干细胞制造、基因、肽、蛋白、寡核苷酸的开发、细胞疗法、疫苗开发、临床前目标验证、安全性/有效性研究和临床试验等领域的领先期刊。《Molecular Therapy》致力于促进遗传学、医学和生物技术的科学发展，影响因子为6.698。

基因工程细胞的同质性对于很多应用都是必要条件，例如细胞株开发、基因ZL、组织工程以及细胞ZL与再生医学。CRISPR/Cas9基因编辑存在脱靶等情况，无法直接得到均质的细胞，因此需要开展单细胞克隆，之后才能用于临床。

CloneSelect单细胞分离系统（CloneSelect Single Cell Printer）采用类似喷墨打印的技术，柔和地产生包裹细胞的液滴无接触地直接分配到微孔板中（图1）。同时，该系统借助智能图像分析，确认细胞数目，分析细胞的形态（大小和圆度）及荧光强度，联动的真空装置将不符合要求的液滴（如空液滴或者含多个细胞的液滴）直接吸走，而符合要求的细胞液滴则分配至微孔板，从而实现对单个细胞的分选和接种。单细胞分离系统是一种可比移液器操作的柔和的单细胞分离技术，而流式分选由于高的液体剪切力和电压的影响，会降低敏感细胞和部分受损细胞（如电转后的细胞）的成克隆率，因此单细胞分离系统更适用于基因工程细胞的克隆，维持细胞活力，并提供直接的单克隆性图像证据。

图1：CloneSelect f.sight单细胞分离系统

最近发表的一篇文章（Characterization of CRISPR/Cas9 RANKL knockout mesenchymal stem cell clones based on single-cell printing technology and emulsion coupling assay as a low-cellularity workflow for single-cell cloning），作者用CRISPR/Cas9对间充质干细胞（MSC）开展RANKL基因敲除以提高其骨骼形成能力。整个实验流程起始于转染，接着用CloneSelect f.sight单细胞分离系统开展单细胞克隆，随后在DNA、RNA以及蛋白质水平开展分析，ZH开展细胞功能分析（图2）。

图2：基因编辑间充质干细胞的单细胞克隆及分析流程。（图片来源：文献1）。

作者在CRISPR/Cas9基因敲除质粒中加入了GFP基因，转染间充质干细胞后，用具备荧光分选功能的CloneSelect f.sight系统分选出转染成功的单细胞。系统可设定细胞直径、圆度和荧光强度等指标，分选出单个活细胞并接种至微孔板。图3为系统分选基因编辑的间充质干细胞的5张连续的图像。通过浏览单细胞分离过程中记录的5张连续的图像，作者统计单细胞接种的成功率为93.9±2.7%（n=451），即仅有~6%的孔为多细胞孔，或空孔或无法确认（图4）。这一结果表明f.sight单细胞分离系统可以准确地识别细胞并成功将其接种至微孔内。

图3：CloneSelect f.sight系统分选间充质干细胞时采集的5张连续图像，可用于证明单克隆性。（图片来源：文献¹）。

除了带GFP的基因敲除质粒外，作者还将pmaxGFP质粒转染至间充质干细胞作为对照用于评估单细胞分离效率和克隆率。此外，作者转染了多个不同的基因敲除质粒。虽然不同的质粒因为大小不同而呈现各异的转染效率，但是成克隆率都达到了30%。此外，作者还发现转染质粒的间充质干细胞（31.3±8%）和未转染的间充质干细胞（39.6±15.6%）在成克隆率上差异较小，这也表明f.sight的单细胞分选过程柔和，因此产生的系统偏差较小（图4）。

图4：CloneSelect f.sight单细胞分离系统的高接种效率（左）和高成克隆率（右）。（图片来源：文献¹）。

接着作者采用surveyor assay、RT-PCR和emulsion coupling分别从DNA、RNA和蛋白质水平对基因编辑后的间充质单细胞开展分析。ZH作者选出一株双等位基因敲除的间充质干细胞（g23d）检测其成骨分化的能力，并以未编辑的MSC为对照开展平行实验。细胞转移到成骨分化培养基后，分别在第7天、14天和21天用茜素红染色。在第14天，细胞失去细长的成纤维细胞样形态，开始呈现出成骨细胞样的形态，然后在第21天开始出现钙沉积，发展过程与亲本的MSC对照类似（图5）。这表明基因编辑后的MSC其成骨分化能力并没有因为基因编辑和筛选过程而受到影响。

图5：RANKL基因敲除的间充质干细胞（g23d）和亲本间充质干细胞的培养和成骨分化。（图片来源：文献1）。

在这个研究中，作者搭建了一整套实验流程，起始于CRISPR/Cas9基因编辑，单细胞克隆以及DNA、RNA和蛋白质各个水平的分析和细胞功能测试。实验流程中采用CloneSelect f.sight单细胞分离系统成功GX地分选出基因编辑后带GFP的间充质干细胞。单细胞接种效率高达93.9% (± 2.7%)，且成克隆率高达31.3% (±8%)。相比传统的有限稀释法和流式分选，CloneSelect单细胞分离系统具有GX率，高活率，操作简单，单克隆性证据充分等优势，是基因工程细胞克隆的理想工具。

基因编辑技术指能够让人类对目标基因进行“编辑”，实现对特定DNA片段的敲除、加入等。而CRISPR/Cas9技术自问世以来，就有着其它基因编辑技术无可比拟的优势，技术不断改进后，更被认为能够在活细胞中最有效、最便捷地“编辑”任何基因。

但是在CRISPR基因编辑之后，工作并没有结束，你需要验证感兴趣的基因是否成功突变。想知道如何利用高灵敏度、高jingzhun度的数字PCR技术来检测基因编辑吗？快来参加本次深蓝云直播课堂吧！

近年来，随着法规的推动，制药人士对于分析方法生命周期的关注度越来越高。USP通则<1220>分析方法生命周期已于2022年5月1日生效，ICH Q14<分析方法开发>也已结束第三阶段公开征求意见阶段。ICH Q14指出，在分析方法开发时，可以使用基础（即传统型）方式或加强型方式。本文案例即使用加强型方式 — Fusion QbD软件辅助生物药分析方法开发。

摘要 

生物药分析部门花费了大量时间开发耐用性好的分析方法，以保证原料药和成品是纯的，稳定的。为了快速将产品应用到患者身上，研发组织不断地加快方法开发流程。提高分析方法开发效率的一个方法就是使用自动筛选和自动方法优化工具。

Fusion QbD软件可支持色谱不同分离模式的自动筛选流程。Fusion允许客户输入与分离模式相关的几个因素进行研究。然后基于统计学设计实验以评估这些因素的影响。设计好的DoE实验可导入Empower，并自动在Empower中创建仪器方法和样品组，减少方法开发过程中大量的人工工作量。Empower运行样品后，结果再一键导入Fusion中做建模分析，评估各色谱参数。

Fusion-Empower工作流程 

在Fusion QbD中生成用户自定义考察因素的DoE实验设计。Fusion将仪器方法写入到Empower中，处理后的样品结果再导入Fusion中分析，得到更优的色谱条件。

图1.  Fusion Empower工作流程

案例1- WCX模式方法开发

• Fusion QbD自动筛选和自动优化；

• 通过Fusion产生69个仪器方法和样品组，并导入到Empower3； 

• 5个小时人工，120小时仪器运行时间；

• DoE实验考察因素：pH、梯度时间、流动相组成、有机添加物、盐浓度和柱温；

• QbD开发的分析方法结果显示：主峰峰形改善，酸性系列峰和碱性系列峰的分离度都提高了；

• 图2为QbD开发好的分析方法和之前传统方式开发了5个月的方法色谱对比图：

图2. WCX 液相分离模式（A. 传统方式开发的分析方法色谱图 ；B. Fusion QbD开发的色谱图，显示酸性系列峰和碱性系列峰的分离度都得到提高）。

案例1 - 叠加图

将Empower结果导入到Fusion中，产生WCX HPLC叠加图。基于客户定义的方法性能指标，白色区域是可接受性能区域，有颜色的区域是不满足性能要求的区域。

图3. 叠加图显示白色区域为满足性能要求的可接受性能区域（左图：盐浓度vs梯度时间。右图：盐浓度vs. pH）。

案例2 - HILIC方法开发 — Fusion QbD筛选

• Fusion QbD产生的38个仪器方法导入到Empower；

• 2个小时人工，15个小时仪器运行时间；

• DoE实验考察的因素：pH、柱温、梯度时间；

• 得到的分析方法显示蛋白1和蛋白2的分离度提高，两个蛋白的拖尾因子降低。

图4. HILIC液相分离模式（A. 传统方法开发的分析方法色谱图；B. Fusion QbD开发的分析方法色谱图，显示蛋白1和蛋白2的分离度提高，拖尾因子降低）。

 结论 

Fusion QbD成功用于生物药的方法开发，首先生成HILIC和阳离子交换模式的DoE实验设计。然后使用Fusion中的导出功能，在Empower中自动创建DoE设计好的仪器方法和样品组。通过自动筛选功能，HILIC方法实现了提高两个蛋白峰的分离度目标，阳离子交换方法实现了分离峰的数量和分离度的提高目标。在Empower3中处理好的结果导入到Fusion，经过统计和建模分析，得到了各个参数的操作空间(MODR)。使用Fusion QbD做方法开发节约的人工，大约为2.5个人工(FTE)一个月的工作时间。