数字PCR|德国汉堡大学基于单细胞基因编辑低频脱靶新方法

CRISPR-Cas9技术彻底改变了基础生物研究和应用生物技术的许多领域。但在临床基因治疗实施中脱靶效应的检测仍然存在难题。德国汉堡大学-艾本多夫医学中心（UKE）干细胞移植、细胞和基因治疗研究所的学者们近日在知名杂志《Molecular Therapy》上发表“LATE–a novel sensitive cell-based assay for the study of CRISPR/Cas9-related long-term adverse treatment effects”的文章，建立了称为LATE（长期不良治疗效果鉴定检测）的新型检测方法，该方法使用Stilla naica®微滴芯片数字PCR系统检测低频的脱靶事件，且有助于分析Cas9脱靶切割效应的影响，并可在单细胞层面进行评估。

为了证明LATE方法有助于检测Cas9脱靶切割后的功能影响，研究人员进行了小规模的原理验证实验：明星基因TP53基因敲除后会导致细胞表现出相对生长优势，这是主要的致瘤性标志之一，因此可以作为验证“LATE”检测脱靶能力的指示。本文选取TP53进行CRISPR靶向实验，并转染到有限稀释后的原代人类新生儿包皮成纤维NUFF细胞中，通过“LATE”方法重复检测到低频(<0.5%)生长促进事件，这一结果证明了即使在低起始细胞数的情况下，LATE检测也具有高灵敏度，并且可以对单个细胞进行评估。

图 1. LATE检测原理

LATE检测的原理包括 (1)用编码荧光蛋白、设计的核酸酶(Cas9)和gRNA的慢病毒载体转导原代人类新生儿包皮成纤维细胞 (NUFF)，(2) 使用流式细胞术分析转导率并连续监控长达10周，(3)读取结果，随着转导细胞数量的增加，作为基因组编辑效应的细胞获得生长优势

在这一过程中，“LATE”读取到的阳性结果（获得生长优势的细胞）会不会由TP53以外的基因被“脱靶敲除”引起，或者是序列存在其他的突变，例如插入诱变从而导致细胞获得生长优势呢?为了研究“LATE”检测的阳性结果与TP53插入缺失之间的联系，研究人员设计了GEF-dPCR（gene-editing frequency digital PCR）实验，即Drop-Off分析方法，该方法可以量化gRNA结合位点以及脱靶位点的插入缺失频率。

图2. NUFF细胞获得的生长优势与TP53中的插入/缺失频率相关 (A)TP53外显子4片段和GEF-dPCR中使用的FAM、HEX标记探针的示意图。(B) TP53插入/缺失频率，数据由GFR-dPCR测量获得。(C) 脱靶TP53插入/缺失频率，由GEF-dPCR测量获得。

对于TP53 gRNA结合位点的检测，GEF-dPCR使用两个双标记水解探针，一个HEX标记探针与远离gRNA识别序列的区域结合，易发生插入缺失的位点设计FAM标记的探针（图2A）。

文中使用Stilla naica®微滴芯片数字PCR系统进行GFR-dPCR方法检测，实验方法详见原文第12页。

随后进行Stilla naica®微滴芯片数字PCR系统检测，结果显示随着时间的推移，TP53插入缺失的频率随之增加，转导后第7天插入缺失率为1%–22%，在52天后达到44%–85%的峰值，该变化趋势和细胞获得生长优势的趋势一致。（图2B）

研究人员还对TP53脱靶位点的插入缺失频率进行了检测（图2C）。上述dPCR检测结果也与NGS测序方法和RGB荧光标记方法一致，从而说明“LATE”能够检测TP53介导的gRNA的不良脱靶效应，但这些gRNA并没有被常用的在线预测工具标记为“危险信号”。

随后，作者还验证了“LATE”可用于任何类型的设计核酸酶以及不同的CRISPR/Cas变体，并且可以扩展用于其他细胞类型，尤其是高度相关的原代hMSC。因此，“LATE”实验方案可用于验证特定细胞类型中特定设计核酸酶的脱靶效应的影响。

图3：LATE检测可应用于hMSCs和h-TERT永生化细胞

综上，“LATE”可以作为一种简单、快速和经济的技术手段，用来评估CRISPR/Cas系统带来的生理“副作用”影响，辅助临床前的安全性研究，是对基于NGS的全基因组脱靶检测方法的有效补充，特别是补充了流式和数字PCR的检测结果。

期刊介绍：《Molecular Therapy》是美国基因治疗学会(ASGT)的月刊，是基因转导、载体开发与设计、干细胞制造、基因、肽、蛋白、寡核苷酸的开发、细胞疗法、疫苗开发、临床前目标验证、安全性/有效性研究和临床试验等领域的领先期刊。《Molecular Therapy》致力于促进遗传学、医学和生物技术的科学发展，影响因子为6.698。

11月19日北京时间23:00（巴黎时间：17:00），欧洲分子生物学实验室研究员Moritz Kueblbeck将于Genomeweb平台在线分享“在CRISPR编辑的细胞系中使用数字PCR进行标记拷贝数评估”相关知识。

本网络研讨会将介绍如何使用dPCR快速定量CRISPR编辑的HeLa细胞中的绿色荧光蛋白拷贝数。讨论还将介绍dPCR的工作原理和采集后的数据分析方法。

Moritz Kueblbeck在德国海德堡的癌症研究ZX(DKFZ)做了八年的研究员。2014年,他加入了Jan Ellenberg在海德堡的欧洲分子生物学实验室,在不同实验室的项目中，他使用CRISPR/Cas9方法利用内源性的标记蛋白(在HeLa和U-2 OS细胞进行不同标签的纯合敲入)进行人类细胞系基因组编辑。

内容简介

l  荧光蛋白或自标记是使用荧光显微镜研究活细胞中蛋白质动力学的宝贵工具。然而，定量成像需要目标蛋白(POI)的生理表达水平，特别是当需要研究POI的化学计量相互作用时。

l  CRISPR使研究人员能够标记几乎任何感兴趣的目标基因，使其可以研究相应POI的生理表达水平。然而，正确编辑细胞克隆的产生和选择——即标记等位基因的预期数量和缺乏额外的整合——需要对标记的拷贝数进行定量评估。

l  探讨dPCR是一种快速、可靠的荧光标记CRISPR编辑细胞定量检测方法。

注册地址：https://event.on24.com/eventRegistration/EventLobbyServlet?target=reg20.jsp&partnerref=stilla&eventid=2111188&sessionid=1&key=2206BD6DA2548F0F9C46911E3A71DD

基因工程细胞的同质性对于很多应用都是必要条件，例如细胞株开发、基因ZL、组织工程以及细胞ZL与再生医学。CRISPR/Cas9基因编辑存在脱靶等情况，无法直接得到均质的细胞，因此需要开展单细胞克隆，之后才能用于临床。

CloneSelect单细胞分离系统（CloneSelect Single Cell Printer）采用类似喷墨打印的技术，柔和地产生包裹细胞的液滴无接触地直接分配到微孔板中（图1）。同时，该系统借助智能图像分析，确认细胞数目，分析细胞的形态（大小和圆度）及荧光强度，联动的真空装置将不符合要求的液滴（如空液滴或者含多个细胞的液滴）直接吸走，而符合要求的细胞液滴则分配至微孔板，从而实现对单个细胞的分选和接种。单细胞分离系统是一种可比移液器操作的柔和的单细胞分离技术，而流式分选由于高的液体剪切力和电压的影响，会降低敏感细胞和部分受损细胞（如电转后的细胞）的成克隆率，因此单细胞分离系统更适用于基因工程细胞的克隆，维持细胞活力，并提供直接的单克隆性图像证据。

图1：CloneSelect f.sight单细胞分离系统

最近发表的一篇文章（Characterization of CRISPR/Cas9 RANKL knockout mesenchymal stem cell clones based on single-cell printing technology and emulsion coupling assay as a low-cellularity workflow for single-cell cloning），作者用CRISPR/Cas9对间充质干细胞（MSC）开展RANKL基因敲除以提高其骨骼形成能力。整个实验流程起始于转染，接着用CloneSelect f.sight单细胞分离系统开展单细胞克隆，随后在DNA、RNA以及蛋白质水平开展分析，ZH开展细胞功能分析（图2）。

图2：基因编辑间充质干细胞的单细胞克隆及分析流程。（图片来源：文献1）。

作者在CRISPR/Cas9基因敲除质粒中加入了GFP基因，转染间充质干细胞后，用具备荧光分选功能的CloneSelect f.sight系统分选出转染成功的单细胞。系统可设定细胞直径、圆度和荧光强度等指标，分选出单个活细胞并接种至微孔板。图3为系统分选基因编辑的间充质干细胞的5张连续的图像。通过浏览单细胞分离过程中记录的5张连续的图像，作者统计单细胞接种的成功率为93.9±2.7%（n=451），即仅有~6%的孔为多细胞孔，或空孔或无法确认（图4）。这一结果表明f.sight单细胞分离系统可以准确地识别细胞并成功将其接种至微孔内。

图3：CloneSelect f.sight系统分选间充质干细胞时采集的5张连续图像，可用于证明单克隆性。（图片来源：文献¹）。

除了带GFP的基因敲除质粒外，作者还将pmaxGFP质粒转染至间充质干细胞作为对照用于评估单细胞分离效率和克隆率。此外，作者转染了多个不同的基因敲除质粒。虽然不同的质粒因为大小不同而呈现各异的转染效率，但是成克隆率都达到了30%。此外，作者还发现转染质粒的间充质干细胞（31.3±8%）和未转染的间充质干细胞（39.6±15.6%）在成克隆率上差异较小，这也表明f.sight的单细胞分选过程柔和，因此产生的系统偏差较小（图4）。

图4：CloneSelect f.sight单细胞分离系统的高接种效率（左）和高成克隆率（右）。（图片来源：文献¹）。

接着作者采用surveyor assay、RT-PCR和emulsion coupling分别从DNA、RNA和蛋白质水平对基因编辑后的间充质单细胞开展分析。ZH作者选出一株双等位基因敲除的间充质干细胞（g23d）检测其成骨分化的能力，并以未编辑的MSC为对照开展平行实验。细胞转移到成骨分化培养基后，分别在第7天、14天和21天用茜素红染色。在第14天，细胞失去细长的成纤维细胞样形态，开始呈现出成骨细胞样的形态，然后在第21天开始出现钙沉积，发展过程与亲本的MSC对照类似（图5）。这表明基因编辑后的MSC其成骨分化能力并没有因为基因编辑和筛选过程而受到影响。

图5：RANKL基因敲除的间充质干细胞（g23d）和亲本间充质干细胞的培养和成骨分化。（图片来源：文献1）。

在这个研究中，作者搭建了一整套实验流程，起始于CRISPR/Cas9基因编辑，单细胞克隆以及DNA、RNA和蛋白质各个水平的分析和细胞功能测试。实验流程中采用CloneSelect f.sight单细胞分离系统成功GX地分选出基因编辑后带GFP的间充质干细胞。单细胞接种效率高达93.9% (± 2.7%)，且成克隆率高达31.3% (±8%)。相比传统的有限稀释法和流式分选，CloneSelect单细胞分离系统具有GX率，高活率，操作简单，单克隆性证据充分等优势，是基因工程细胞克隆的理想工具。

【数字PCR网络研讨会】

在CRISPR编辑的细胞系中

使用数字PCR进行标记拷贝数评估

       11月19日北京时间23:00（巴黎时间：17:00），欧洲分子生物学实验室研究员Moritz Kueblbeck将于Genomeweb平台在线分享“在CRISPR编辑的细胞系中使用数字PCR进行标记拷贝数评估”相关知识。

本网络研讨会将介绍如何使用dPCR快速定量CRISPR编辑的HeLa细胞中的绿色荧光蛋白拷贝数。讨论还将介绍dPCR的工作原理和采集后的数据分析方法。

Moritz Kueblbeck在德国海德堡的癌症研究ZX(DKFZ)做了八年的研究技术员。2014年,他加入了Jan Ellenberg在海德堡的欧洲分子生物学实验室,在不同实验室的项目中，他使用CRISPR/Cas9方法利用内源性的标记蛋白(在HeLa和U-2 OS细胞进行不同标签的纯合敲入)进行人类细胞系基因组编辑。

内容简介

l  荧光蛋白或自标记是使用荧光显微镜研究活细胞中蛋白质动力学的宝贵工具。然而，定量成像需要目标蛋白(POI)的生理表达水平，特别是当需要研究POI的化学计量相互作用时。

l  CRISPR使研究人员能够标记几乎任何感兴趣的目标基因，使其可以研究相应POI的生理表达水平。然而，正确编辑细胞克隆的产生和选择——即标记等位基因的预期数量和缺乏额外的整合——需要对标记的拷贝数进行定量评估。

l  探讨dPCR是一种快速、可靠的荧光标记CRISPR编辑细胞定量检测方法。

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数字PCR技术自1999年提出概念，实现了目标核酸拷贝数浓度的JD定量的技术突破，为核酸JZ定量和基因检测提供了全新的思路。

数字PCR技术具备无需标准品、高JZ度、高灵敏度、高分辨力、多通道等技术特点，目前广泛应用于前沿生命科学应用领域，如先进的基因/细胞ZL、干细胞移植、病原微生物定量、肿瘤个体化诊疗/液体活检等多个前沿领域，为生命科学、临床医学、药物开发、计量科学等科学家探索更高灵敏度、更JZ测量，提供了全新的路线和工具。

为更好地让广大学者了解数字PCR技术，快速完成qPCR方法到数字PCR方法的转化，Gene-π数字PCR学堂——核酸JD定量分析及高阶多重数字PCR应用训练营（西湖大学站）将于2021年07月19日在杭州召开。聚焦于数字PCR原理、实验操作、应用进展、结果分析、高阶多重dPCR实验方案、生物医药研究领域中数字PCR技术的方法及应用等核心内容，训练营将携ZS技术专家，为广大学员带来从理论到实战、从入门到精通的饕餮盛宴。

培训时间地点

时间：2021年07月19日

地点：浙江杭州西湖大学-云栖校区--3号楼312会议室

培训日程

参会报名

您在PCR实验操作中是否遇到过问题？如何在实验过程中设置质控要求？在什么浓度范围内检测是准确的？数字PCR的ZD检测限如何评估？数字PCR引物探针设计和qPCR有什么区别及如何评估其质量？在本次训练营中都可以得到答案，心动了吗？心动了就赶紧报名吧！场地有限，报名从速哦。可以通过扫描下方二维码进行报名哦！

敲黑板了！

我们的初衷是--真诚地把先进技术和应用带给大家!

只要您提交了报名申请，经主办方审核通过后，收到报名成功确认通知，就可以参加我们的培训班啦！因场地有限，先到先得哦。赶紧报名吧！

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详情咨询方式：电话：010-57256059，15801106547 邮箱：info@cycloudbio.com

一篇在线发表于《细胞》杂志的论文介绍了一项重要突破：来自韩国的研究团队***在线粒体DNA中实现A碱基到G碱基的转换，为基因编辑技术填补上一块***关重要的拼图，也带来了治愈多种线粒体遗传病的希望。

从上世纪60年代***发现***性内切酶，到1985年发明PCR技术，再到***近十年CRISPR技术诞生、用于活体生物的基因编辑，短短半个世纪，人类在一次又一次的突破中实现了操纵DNA能力的巨大飞跃。其中，CRISPR的出现更是让科学家能高效编辑基因组中的致病突变，为众多遗传病提供全新的方案。

不过，还有一朵乌云长期笼罩在基因编辑领域的上空，这就是线粒体DNA的编辑。

作为参与能量代谢的重要细胞器，线粒体中也含有少量来自母系的DNA。如果这部分基因发生突变，则可能导致多种与代谢相关的遗传疾病。

例如，Leber遗传性视神经病变（LHON）可能导致患者失明，这种凶险的疾病就是由线粒体DNA的点突变导致的。线粒体DNA突变还可能导致某些线粒体脑肌病，患者的大脑遭受损伤，可能出现癫痫、精神行为异常等症状。平均每5000个人里，就有一个人患上线粒体点突变导致的遗传病。

尽管基因编辑工具***近十年迎来爆发式发展，但面对线粒体遗传病时，这些工具却总是难以奏效。例如，当下***为盛行的CRISPR-Cas系统就因为向导RNA不能穿越线粒体膜，因而无法用于线粒体疾病。

线粒体DNA的编辑，可以说是基因编辑领域***后一块未经涉足的土地，而这个难题也成为治愈多种遗传疾病必须跨越的障碍。

2020年，一项***性的突破到来。Broad研究所的刘如谦教授团队开发了一款名为DdCBE的基因编辑工具，可以直接修改双链DNA上的碱基，实现从C碱基到T碱基的转换，这也是科学家***在人体细胞中进行线粒体DNA的编辑。

不过，作为线粒体DNA编辑的开拓性成果，DaCBE也有不足之处：其只能高效地进行TC-TT序列的转换，在90个已知的致病线粒体突变位点中，只有9个能得到修复。

而在这90个突变位点中，有多达39个都可以通过A-G碱基的转换来修复。如果能找到实现A-G转换的手段，那么包括上述两种疾病在内，多种线粒体遗传病都有望迎来治愈的方法。

在这项发表于《细胞》的***新研究中，来自韩国基础科学研究所基因编辑中心的研究团队终于完成了这项“不可能的任务”，他们开发出一款全新的基因编辑平台，命名为转录激活因子样效应物相关脱氢酶（transcription activator-like effector-linked deaminases，简称TALED）。

▲TALED编辑线粒体DNA的示意图

论文***作者CHO Sung-Ik表示：“我们设计的新型碱基编辑器极大地拓展了线粒体DNA编辑的范围，这不仅有助于构建疾病模型，还将帮助人们开发新疗法。”

TALED到底是什么？接下来我们将看到，TALED由3个功能各异的主要部分组成，它们环环相扣、共同协作，***终完成这项基因编辑任务。

***个部分，可以看作TALED的向导。前面说到，常见的基因编辑系统无法进入线粒体。为了解决这个问题，TALED与刘如谦团队开发的DaCBE一样，使用了转录激活因子样效应物（TALE）。作为一种DNA结合蛋白，TALE蛋白能够靶向特异的DNA序列，其在线粒体靶向序列（MTS）的引导下进入线粒体，并且与特定的线粒体DNA序列结合。

到这里，TALED就被带到了工作场所。在这里，轮到TALED的第二个部分登场。研究团队需要找到合适的脱氢酶，在这里实现A-G碱基的转换。为此，他们选择是名为TadA8e的腺嘌呤脱氢酶，其由大肠杆菌的腺嘌呤脱氢酶改造而来。

这个选择颇具创意，因为TadA8e被认为是一种专门对单链DNA起作用的蛋白，但在这里，它需要在线粒体的双链DNA中进行碱基编辑。

这篇论文的通讯作者，基因编辑中心主任KIM Jin-Soo教授说：“没有人想过用TadA8e在线粒体中进行碱基编辑，因为它被认为只对单链DNA起作用。正是这个跳出传统框架的想法，帮助我们发明了TALED。”

而帮助TadA8e做到这一点的，是TALED的***后一个主要部分：胞嘧啶脱氢酶DddAtox。DddAtox使得双链DNA可以短暂地解开，而TadA8e正是抓住了这个转瞬即逝的时间窗口，在人类细胞的线粒体中高效催化A-G碱基的转换，编辑频率可高达49%。

▲TALED实现了A-G碱基的转换

通过对TALED的调整，研究团队分别开发出能同时实现A-G以及C-T碱基转换的技术，以及仅进行A-G转换的技术。

当然，作为一项开创性的技术，TALED仍有不***之处，例如在进行碱基编辑时，可能会造成与目标位点相邻的核苷酸也发生转换；此外，TALED是否会在哺乳动物细胞中产生脱靶效应也有待观察。

但毫无疑问，TALED技术的出现让我们又多了一种***潜力的基因编辑工具，展望这项技术的未来应用场景，研究团队希望能提升TALED的编辑效率与特异性，***终能够分别在胚胎、新生儿与成年患者体内修正致病的线粒体突变。我们期待，那些受困于线粒体遗传病的人们终将迎来治愈的一刻。

RNA提取磁珠属于纳米生物磁珠的一种，主要作用是用于核酸提取过程中的RNA提取，粒径分布在500nm左右，是洛阳吉恩特生物自主研发生产的高分子纳米磁性微球，该磁珠悬浮时间长，磁响应时间迅速，对DNA甲基化过程中的提取环节提供良好的支持，可明显缩短实验时间，提高实验效率，并在提取结果上保持稳定，配合核酸提取仪，更能实现快速的RNA提取。

基因编辑技术指能够让人类对目标基因进行“编辑”，实现对特定DNA片段的敲除、加入等。而CRISPR/Cas9技术自问世以来，就有着其它基因编辑技术无可比拟的优势，技术不断改进后，更被认为能够在活细胞中最有效、最便捷地“编辑”任何基因。

但是在CRISPR基因编辑之后，工作并没有结束，你需要验证感兴趣的基因是否成功突变。想知道如何利用高灵敏度、高jingzhun度的数字PCR技术来检测基因编辑吗？快来参加本次深蓝云直播课堂吧！

从1985年至今的30多年时间里，PCR分析经历了三代技术的发展。DY代传统PCR技术，采用琼脂糖凝胶电泳的方法对PCR产物进行定性分析。第二代荧光定量PCR技术，通过在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号的积累实时监控PCR进程，ZH用Cq值对基因进行定量分析。第三代数字PCR技术，通过将PCR反应液进行有限稀释，实现核酸分子的单分子扩增，ZZ采取终点法检测阳性微滴的荧光信号，有荧光信号的微滴判读为 1；没有荧光信号的微滴判读为 0，因此该技术被称为数字PCR。

PCR技术在不断地蜕变却从未淡出我们的视野，如今已经渗透到分子生物学领域的各种研究层面。尤其在今年大流行疾病中，展现了PCR技术的强大之处。那在科学研究中，我们该如何选择传统PCR 、荧光定量 PCR与数字 PCR呢？

首先我们要清楚，三代PCR技术所有的基础源于PCR反应的基本原理和PCR反应的3个重要阶段，分别是指数期、线性期和平台期。

指数期

指数期内，每个循环PCR产物量大约增加1倍（假定 100%反应效率），该阶段的扩增反应具有高度特异性和精确度。

线性期（高变异性）

随着PCR反应体系成分的消耗，其中的一个或者多种成分限制反应，导致反应开始减缓，并且每个循环的PCR 产物不再加倍。

平台期

反应停止，不再产生更多的产物。因为每个样品具有不同的反应动力学，所以每个反应将在不同的时间点进入平台期，平台期内可以看到这些差异。

传统 PCR

传统PCR通过琼脂糖凝胶电泳对PCR终产物进行分析（图2），它的局限性就在于只能做定性分析。在图3中，3个反应孔含有相同量的 DNA模板，但到达平台期后产生的荧光信号却不同，说明扩增产物的量存在不同（反应动力学变化所致）。这也表明了传统PCR平台期测量时结果存在变异，产出的DNA量不一定能反映最初情况，所以无法进行定量。

荧光定量 PCR

同样在图3中，发现在指数期内，3个反应孔的扩增曲线完全重合，说明指数期内进行检测将更加精确，可实现更加准确的定量。阈值线是扩增产物荧光强度超过背景时的一个荧光强度值，样品达到此荧光强度值所经过的循环数称为Cq值。通过比较未知浓度的样品与一系列标准品的Cq值，可以精确测定未知反应中的模板 DNA数量。

数字 PCR

数字 PCR 是通过将样本DNA随机分布至独立的反应单元中，每个反应单元中包含或者不包含1个或多个拷贝的目标分子，所有独立的反应单元进行平行扩增后，对每个反应单元的阴性或者阳性荧光信号进行检测并进行统计学分析，就可以计算出原始样本的拷贝数，无需参考标准品或内源性对照品，也不需要标准曲线。

传统PCR 、荧光定量 PCR与数字 PCR的选择

深蓝云生物科技为您提供美国Azure Cielo 3/6通道荧光定量PCR系统和

        法国Stilla Naica全自动3色/6色微滴芯片数字PCR系统。

Azure  Cielo™实时荧光定量PCR系统

来自于美国Azure Biosystems公司，为您提供Azure Cielo-3通道和Azure Cielo-6通道，可根据实验需求灵活配置。这款产品采用了高能LED作为光源系统，可保证光源强度高，光源一致性好；高品质的帕尔贴温度模块作为温控系统，升降温速率快，可设置12列跨度30°C的温度梯度；ZY的CMOS拍照+光纤信号传输作为检测系统，CMOS检测灵敏度高，光纤传输速度快，无光损失和干扰。Azure Cielo™实时荧光定量PCR系统可为您的科学研究提供高JZ度、高灵敏度和高可靠性的实验结果。

Naica™微滴芯片式数字PCR系统

法国Stilla Technologies Naica数字PCR平台是实现高灵敏DNA/RNAJD定量的技术工具，只需一步移液操作，即可自动生成单层平铺的微滴，同一反应液进行多基因的单分子模板扩增，通过三色或六色荧光通道检测，自动QC质控，识别多色荧光中有效的阴阳性微滴，从而达到目的DNA/RNA的高JZjuedui定量。同时提供原始数据、单微滴追溯等功能，确保数据真实可靠。

参考文献：

1. Sykes PJ, Neoh SH, Brisco MJ, Hughes E, Condon J, Morley AA. Quantitation of targets for PCR by use of limiting dilution. Biotechniques. 1992;13(3):444-449.

2. Vogelstein B , Kinzler K W . Digital PCR[J]. Proceedings of the National Academy of ences of the United States of America, 1999, 96(16):9236-9241.

3. Heyries KA, Tropini C, Vaninsberghe M, et al. Megapixel digital PCR. Nat Methods. 2011;8(8):649-651.

4. Dingle TC, Sedlak RH, Cook L, Jerome KR. Tolerance of droplet-digital PCR vs real-time quantitative PCR to inhibitory substances. Clin Chem. 2013;59(11):1670-1672.

5. Whale AS, Huggett JF, Cowen S, et al. Comparison of microfluidic digital PCR and conventional quantitative PCR for measuring copy number variation. Nucleic Acids Res. 2012;40(11):e82.

导读

在过去的几十年中，糖尿病的发病率在显著增长。除了不健康的生活方式外，环境污染物被认为是糖尿病发生的危险因素。多环芳烃 (PAH)是一类含有2-7个芳环的有机化合物，由自然和人类活动产生并广泛存在的污染物。流行病学研究表明，PAHs水平与成人和儿童的肥胖和二型糖尿病相关。

厦门大学生命科学学院细胞应激生物学国家重点实验室的研究人员在Ecotoxicology and Environmental Safety上发表了题为《Prenatal exposure to a mixture of PAHs causes the dysfunction of islet cells in adult male mice: Association with type 1 diabetes mellitus》的文章。文中应用naica®微滴芯片数字PCR系统对胰岛素编码基因DNA甲基化水平进行量化，揭示了产前暴露于多环芳烃混合物对成年雄性小鼠胰岛细胞功能的不良影响。

应用亮点：

▶  使用naica®微滴芯片数字PCR系统对胰岛素编码基因启动子甲基化水平进行量化。

▶ 在产前暴露于500µg/kg PAHs的小鼠中，胰岛素编码基因启动子的甲基化水平显著升高。

▶ 产前暴露于PAHs可能促进I型糖尿病的发病。

作者使用8种PAHs的混合物进行了实验，以研究产前PAHs对成年期胰岛细胞功能和质量的影响，同时试图阐明 I型糖尿病发病的环境原因。他们分离了成年雄性小鼠的胰岛，对胰岛素编码基因的启动子DNA甲基化水平进行分析。

研究成果：

▲图1. 产前暴露于多环芳烃对成年雄性小鼠胰岛素编码基因甲基化水平的影响。(A) 数字PCR结果代表性一维图。(B)胰岛素编码基因启动子甲基化水平。(每个处理三只母鼠, 每只母鼠取一个雄性后代) 。

在本研究中，子宫内暴露于500µg/kg PAHs的小鼠胰岛中胰岛素编码基因启动子中的DNA甲基化水平显著增加，同时胰岛素编码基因转录显著下调。

▲图2. 不同PAHs浓度对胰岛素编码基因转录水平的影响

期刊介绍：

Ecotoxicology and Environmental Safety 1977创刊，隶属于爱思唯尔出版集团。是一份多学科交叉期刊，主要研究环境污染对包括人类健康在内的生物体的暴露和影响。最新影响因子为7.129。

naica®六通道数字PCR系统

法国Stilla Technologies公司naica®六通道数字PCR系统，源于Crystal微滴芯片式数字PCR技术，自动化微滴生成和扩增，每个样本孔可实现6荧光通道的检测，智能化识别微滴并进行质控，3小时内即可获得至少6个靶标基因的绝对拷贝数浓度。

张觉超

新技术的诞生往往会为行业的发展做出一些贡献。今天，我们通过解读匹兹堡大学Cell DIVE^TM用户在《Nature Communication》杂志上发表的题为“Spatial domain analysis predicts risk of colorectal cancer recurrence and infers associated tumor microenvironment networks”的研究论文[1]，感受一下徕卡Cell DIVE^TM给予结肠癌预后推断方法革新的“推背力”。

研究背景

结直肠癌（Colorectal Cancer，CRC）是三大癌症类型之一，占癌症相关死亡人数的第二位（图1）[2]。虽然CRC患者采用成熟的TNM分型进行分期和ZL，但肿瘤的异质性导致相同分型结肠癌患者的预后大相径庭。统计数据表明，相当比例的CRC患者术后1-2年出现癌症复发和转移，进而生命健康受到危害[2]。而术后积极复查并进行巩固ZL则能够避免结肠癌复发风险。随着对CRC研究的深入，研究人员发现CRC异质性在肿瘤微环境中有所体现，并与患者预后存在相关性[3]。针对这一发现，人们利用肿瘤分子表型、肿瘤微环境组成和肿瘤内T细胞浸润等指标进行结肠癌预后预测和判断方法的建立[4]。近年来，已有一些结肠癌预后判断的方法被提出（如Immunoscore®等）。但现有的预后推断方法多基于传统病理技术，被单次检测标记抗体的数量所限制，无法做到多指标和空间信息兼顾的全面检测，导致CRC预后推断方法的开发遭遇瓶颈。多重标记免疫组化技术的发展帮助我们突破了这一限制。今天我们关注这篇文章的作者就是利用了徕卡Cell DIVE^TM超多标组织成像分析技术实现了CRC预后推断新方法——计算分析与系统生物学平台（analytics computational and systems biology platform，SpAn平台）的建立。

图1 不同种类癌症新增病例和死亡比例统计图（2018年）[2]

研究简述

文章的作者在Cell DIVE^TM开发阶段就关注了其前身技术（MultiOmyx技术）在CRC微环境检测方面的潜力，并在Cell DIVE^TM上市后，优先将其用于CRC预后推断方法的开发。在Cell DIVE^TM的帮助下，作者非常轻松的完成了实验设计中的抗体选择环节。作者从Cell DIVE^TM认证的400余种抗体的资源库中选取了55个生物标志物作为检测目标：其中包括常见的上皮、免疫和基质细胞谱系及分类标记分子，还包括与CRC分型相关信号通路中的关键蛋白、胞外运输和代谢相关的分子标记、肿瘤抑 制能力相关的功能蛋白、癌基因相关的生物标志、细胞粘附相关蛋白、细胞和基质结构相关的分子标记、细胞类型及其状态相关的特征分子等。

图2 结肠癌组织超多标荧光组化成像（标尺，100 μm）

随后，作者利用Cell DIVE^TM成像仪对美国Clearview癌症研究所收集到的432例TNM分期在I至III期CRC患者的组织微阵列样本进行超多标荧光免疫组化成像（图2），并利用Cell DIVE^TM配套分析软件完成不同肿瘤区域的自动识别（图3）。根据组织结构特异性标记分子将肿瘤微环境分为上皮区域、间质区域及上皮-间质区域（上皮和间质交界处100 μm的间质和恶性上皮细胞相互作用紧密区域）。

图3 结肠癌组织区域自动识别及标志物相关性分析

自动分区完成后，作者展开已检测的55种标志物的相关性分析，并通过递归运算从中找出一系列预后判定标志物（图4）。

图4 SpAn肿瘤微环境区域特异标志物分析

接下来，作者通过人工智能学习把标志分子表达模式和肿瘤微环境空间信息结合，开发出CRC预后推断运算模型SpAn平台，从而成功地将CRC患者分为术后高复发风险组和低复发风险组（图5）。与以往的CRC预后推断方法不同，SpAn平台不需要额外输入患者表型数据，可以完全根据肿瘤微环境的空间蛋白组学信息进行预后推断。

图5 SpAn平台5年CRC复发风险生存曲线检验

ZH，SpAn平台与已有的CRC预后推断方法对比表明，SpAn预测CRC患者5年复发风险的平均AUROC为88.5%（SE=0.1），显著优于目前的方法。相信在不远的将来，SpAn平台能帮助YL工作者为CRC患者JZ地制定术后巩固ZL方案。

Cell DIVE^TM “解密”

回顾SpAn平台的建立，Cell DIVE^TM技术对组织微环境的超多标成像和分析功不可没。下面有请功臣“闪亮登场”：

Cell DIVE^TM超多标组织成像分析整体解决方案，从上游的样品制备，到染色成像，再到下游的数据分析，能够提供一整套实验解决方案，突破传统H&E染色、免疫组化和传统免疫荧光10个biomarkers以内的限制，实现一张肿瘤组织切片上超过60个biomarkers的定性与定量分析，从单细胞水平的层面上，对肿瘤微环境进行空间信息挖掘，助力肿瘤免疫ZL的研究。

当然，如果您还想了解Cell DIVE^TM的更多优点，敬请关注公众号近期的相关文章。

参考文献

[1] Uttam S, Stern A M, Sevinsky C J, et al. Spatial domain analysis predicts risk of colorectal cancer recurrence and infers associated tumor microenvironment networks. Nature Communications, 2020, 11(1).

[2] Freddie, Bray, Jacques, et al. Global cancer statistics 2018: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA: a cancer journal for clinicians, 2018.

[3] Guinney J, Dienstmann R, Wang X, et al. The consensus molecular subtypes of colorectal cancer. Nature medicine, 2015, 21(11):1350-1356.

[4] F Pages, Mlecnik B, F Marliot, et al. International validation of the consensus Immunoscore for the classification of colon cancer: a prognostic and accuracy study. Lancet, 2018, 391: 2128–2139.

[5] Gerdes MJ, Sevinsky CJ, Sood A, et al. Highly multiplexed single-cell analysis of formalin-fixed, paraffin-embedded cancer tissue. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2013, 110(29).

[主题]

    FluidFM：CRISPR基因编辑技术的新突破

[直播时间]

    2020年3月26日，16:00 - 17:00

[报告简介]

    提高转染物质导入细胞核的效率目前仍然是基因编辑中的一大挑战。FluidFM 技术能够将转染物质直接注射到细胞核中，从根本上解决这一难题。这一技术对于极难转染或原代的细胞系的基因编辑有着十分重要的意义。

    本次研讨会是关于“提高CRISPR基因编辑效率的全新方法”的网络研讨会。向您展示如何通过直接向细胞核中导入转染物质，从而解决细胞转染效率低下的问题。

特别提示：本次研讨会还包括在线的实验演示！

[产品简介]

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