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常压蒸馏和薄层分析的实验操作要点,实验原理是什么?

yjwzl520 2013-08-01 00:33:32 493  浏览
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  • fjangel01 2013-08-02 00:00:00
    常压蒸馏即在常压下进行的蒸馏。 原理 溶液受热气化,气化的溶剂经冷却又凝为液体而回收,回收的液体是较纯净的溶剂,从而使提取液浓缩。 用途 适用于低沸点有机溶剂提取液的浓缩回收。 薄层色谱法是一种现代的物理化学分离、分析技术。它既可用于混合物的分离、成品纯度检查。又可用于化合物的定性和定量,尤其对中药中结构相似成分的分离和鉴定往往可获得较好的效果,色谱法是近代Z常用的分离、鉴定方法。色谱法根据操作方式不同,分为薄层色谱,纸色谱和柱色谱。 原理 薄层色谱是将吸附剂或支持剂均匀地铺在薄层板上,形成薄层,把欲分离的样品点在薄层板上,用适当的溶剂展开,使混合物得以分离的方法。薄层色谱是一种微量、快速的色谱方法。用于纯物质的鉴定,也可用于混合物的分离、提纯及含量测定,还可用来摸索和确定柱色谱的洗脱条件。

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  1、包被原的性质很重要,蛋白浓度,是否降解,这关系到你做出的抗体可不可以被其识别,所以保存抗原很重要,我做重组蛋白时,师兄都严格警告我一定要在冰浴下缓慢融化就是这个道理。还有有的包被原可能不是蛋白,对于生物素和脂类物质或小分子物质我们要事先对其改造再加以包被,方法简要的列出如下:

  ①亲和素生物素:先亲和素先包被载体,加入生物素化的DNA,这种包被方法均匀、牢固,已扩大应用于各种抗原物质的定量测定。

  ②脂类物质:可将其在有机溶剂(例如乙醇)中溶解后加入ELISA板孔中,开盖置冰箱过夜或冷风吹干,待酒精挥发后,让脂质自然干固在固相表面。

  


  ③小分子必须依靠和大的蛋白载体偶联后才能固定在固相载体上。

  2、包被液的选择,一般选择ph9.6的碳酸盐缓冲液。但有时由于试验的需要,包被原的特殊性也可能采用中性的缓冲溶液来包。应注意以下原理:由于蛋白质与聚苯乙/烯固相载体是通过物理吸附结合的,靠的是蛋白质分子结构上的疏水基团与固相载体表面的疏水基团间的作用,这种物理吸附是非特异性的,受蛋白质的分子量、等电点、浓度等的影响,大分子蛋白质较小分子蛋白质通常含有更多的疏水基团,故更易吸附到固相载体表面。具体的试验还要有坚固的理论外也要实践,看一下终可不可以应用到自己试验当中去。常用的包被液除了刚才提到的pH9.6碳酸盐缓冲液,还有pH7.2的磷酸盐缓冲液和pH7-8的Tris-HCL缓冲液等等。

  3、封闭:继包被之后用高浓度的无关蛋白质溶液再包被的过程。封闭就是让大量不相关的蛋白质充填这些空隙,从而排斥ELISA后的步骤中干扰物质的再吸附。常用封闭剂有:0.05%-0.5%的BSA;10%的小牛血清或1%明胶;脱脂奶粉,比较价廉,可以高浓度使用(5%-10%);还有一些稀有用到的各种动物血清(主要为了排除相似蛋白干扰)和酪蛋白等等。但终选用什么,要依据试验具体来实践。

  4、洗涤板:可以说在ELISA操作中,洗涤是主要的关键技术。因为聚苯乙/烯等塑料对蛋白质的吸附是普遍性的,为达到分离游离的和结合的酶标记物的目的,清除残留在板孔中游离的物质,以及非特异性地吸附的干扰物质,在洗涤时又应把这种非特异性吸附的干扰物质洗涤下来。所以在洗板时会有一定误差,人为因素很大(当然有条件的用洗板机除外),洗的不彻底或串了孔,对如此灵敏的ELISA系统可是不小的影响。

  5、加抗体标本(和二抗):注意该换枪头时换枪头。标本稀释一般可用PBS稀释,也可用封闭液去稀释。如需加二抗,还要注意二抗的工作浓度,太高浪费,太低则着色浅。

  6、显色:显色系统又很多,我们一开始做的时候,要选择适宜的显色系统。注意显色系统酶活性底物的保存HRP结合物加硫柳泵,AP结合物可加叠氮钠。

  7、每次做尽量要把阴阳空三个对照做好,如出现问题也好分析。

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