ibidi实验方案|如何创建令人惊叹的细胞球体3D图像

　　小鼠 L929 成纤维细胞的多细胞球体是在µ-Slide 球体灌注中创建的。在从细胞悬浮液中形成球体后，使用 ibidi 泵系统进行灌注。添加 ibidi Pump 可确保球体在长期培养过程中获得最佳营养。

　　在灌注培养 1 周后，将球体固定并用鬼笔环肽染色以观察 F-肌动蛋白细胞骨架。最后，球体被清除以增强成像深度和分辨率。我们使用EMOVI 方法进行具有成本效益、无害的整体成像，这可以在固定球体上实现基于抗体的多重免疫标记。球体的清除允许分析整个球体成纤维细胞甚至在球体成纤维细胞中心的成纤维细胞的分布和组织，同时保留球体的形态

　　01材料和试剂

　　细胞和试剂

　　•L929成纤维细胞（DSMZ，编号ACC 2）

　　•Accutase(A1110501,Gibco)

　　•细胞培养基 RPMI-1640 (Gibco, 21875034)

　　•胎牛血清 (FCS, Gibco, 10270106)

　　•细胞内 (IC) 固定缓冲液 (eBioscience, 00-8222-49)

　　•Dulbecco 磷酸盐缓冲液（PBS、Sigma、D8537）

　　•正常小鼠血清（Jackson，015-000-120）

　　•正常驴血清（Jackson，AB_2337258）

　　•Triton X-100（Alfa Aesar，A16046）

　　•Flash Phalloidin™ Green 488（鬼笔环肽；500x，Thermo Fisher Scientific，46410）

　　•4'，6-二脒-2-苯基吲哚（DAPI，浓度20μg/mL，西格玛奥德里奇，D9542）

　　•去离子水 (diH2O)

　　•异丙醇（Carl Roth，CP41.2）

　　•肉桂酸乙酯 (ECi) (Sigma, W243000)

　　02缓冲液和溶液

　　培养基

　　•新鲜制备并在 4°C下储存长达一周

　　•基础培养基 RPMI-1640 (Gibco, 21875034)

　　•10%  FCS （ Gibco，10270106）

　　封闭和染色缓冲液

　　•PBS 

　　•1% （v/v）FCS 

　　•1% (v/v) 正常小鼠血清

　　•1% (v/v) 正常山羊血清

　　•0.3% (v/v) Triton  X-100

　　染色液

　　•封闭和染色缓冲液

　　•1:500 鬼笔环肽（最终浓度 1x）

　　•1:10 DAPI（最终浓度 2 µg/mL）

　　30% / 50% / 70% (v/v) 异丙醇稀释液

　　•混合适当体积的 diH2O 和异丙醇

　　•使用前预冷至 4 °C

　　03 设备   

　　•ibidi 泵系统 (ibidi, 10902)

　　•具有生物惰性表面钝化的 ibidi µ-Slide 球体灌注（ibidi，80350）

　　•用于 µ-Slide 的 ibidi 串行连接器（ibidi，10830）

　　•ibidi 灌注套装蓝色 (ibidi, 10961)

　　•层流罩

　　•培养箱，37°C 和 5% CO2

　　•血细胞计数器（康宁)

　　•移液器(康宁）

　　•倒置共聚焦显微镜（Leica TCS SP8）

　　•徕卡应用套件 X

　　•LIGHTNING（反卷积软件）

　　•Imaris v9.5

　　04 操作程序

　　第一部分：µ-Slide球体灌注中的球体形成和培养

　　请在使用 µ-Slide Spheroid Perfusion 之前阅读指示。所有步骤均需在无菌条件下执行。

　　开始实验之前，在标准细胞培养瓶（例如 T75）中制备 L929 成纤维细胞，细胞粘附在底部。细胞在实验当天应该是健康的并且最佳亚汇合。

　　重要提示：在 37°C 和 5% CO2的培养箱内过夜平衡所有必需的材料，例如载玻片、培养基和管道（灌注套件）。平衡对于防止气泡随着时间的推移而出现至关重要。

　　1. 将60 µl 无细胞培养基注入 µ-Slide Spheroid Perfusion 的每个通道（根据说明用提供的盖玻片封闭）

　　2. 在培养箱中 37°C 孵育 2 小时。孵育期间始终关闭盖子。

　　3. 用 Accutase 处理培养的 L929 细胞 1-2 分钟以使其脱离。

　　4. 收集细胞悬液，离心，在培养基中稀释；量取决于所需的细胞浓度。

　　5. 对细胞计数并调整至终浓度为 5 x 105cells/ml。

　　6. 用无细胞培养基冲洗 µ-Slide 球体灌注的通道，以去除潜在的气泡。

　　7. 将 45 µl 细胞悬液直接移入每个通道。

　　8. 在 37°C 下孵育 1 小时，使细胞在壁孔中沉淀。

　　9. 用60 µl 无细胞培养基填充 µ-Slide Spheroid Perfusion 的储液库。

　　10. 在 37°C 下孵育过夜以形成球体。

　　11. 检查通道是否有气泡。如果通道中存在任何气泡，请用无细胞培养基小心冲洗通道。

　　12. 使用ibidi 串行连接器连接 µ-Slide Spheroid Perfusion 的 3 个通道

　　13. 根据ibidi 泵系统、流体单元和灌注装置指示.

　　14. 将µ-Slide 球体灌注连接到 ibidi 泵系统并开始流动。使用尽可能低的流速（5 mBar 气压导致流速为 0.74 ml/min）。进行实验，直到球体具有所需的成熟状态，在这种条件下培养 7 天后。

　　图1：L929 成纤维细胞在孔中形成球体并在流动条件下培养

　　图 2：L929 成纤维细胞在µ-Slide 球体灌注中显示球体形成。第1 天的示例

　　(A)第 6 天 (B)，使用 ibidi 泵系统灌注，0.74 毫升/分钟。相差显微镜，10 倍物镜，井径 800 µm。

　　第二部分：L929 球体的染色和清除

　　染色直接在 µ-Slide Spheroid Perfusion 中进行。在开始染色之前，请阅读指示并遵循载玻片中关于一般移液和更换溶液的建议。

　　1. 当 L929 球体培养达到所需的成熟状态（此处为 7 天后）时，小心地断开 µ-Slide球体灌注与 ibidi 泵系统的连接。

　　2. 在 RT 处用冷 IC 固定缓冲液固定球体 10 分钟。

　　3. 在 RT 中将球体封闭和染色缓冲液中孵育 1 小时。

　　4. 在 37°C 下用染色溶液孵育球体过夜。从这一点开始，保持载玻片避光。图 3A 显示了清除前的球体成像。

　　5. 第二天，用 Blocking and Staining Buffer 清洗细胞一次。

　　6. 通过在冰上以上升 30%、50% 和 70% 的异丙醇稀释液孵育15 分钟，依次使球体脱水。

　　7.  在冰上用纯异丙醇孵育球体两次 15 分钟。

　　8.  从冰中取出载玻片，让它升温至 RT。

　　9.  执行清除：在 RT 处用纯 ECi 灌注两次。在这个阶段，球体可以避光储存数周，而不会显着损失荧光。

　　10.  使用共聚焦显微镜的图像球体（参见图 3）。

　　图 3：清除前后染色 L929 球体的共聚焦显微镜（红色：鬼笔环肽，青色：DAPI）。

　　(A) 清除前的球体。请注意，由于光散射和吸收，只能看到外围细胞，而看不到中心的细胞。(B, C) 清除后的球体。请注意，清洗前后的尺寸差异源于脱水和清洗过程，同一位置的横截面。(B) 横截面 (C) 体积/3D 视图。球体的清除允许即使在球体成纤维细胞的中心也可以看到细胞，同时保留球体的形态。细胞核的计数甚至可以确定形成该球体的细胞数。

　　点击请查看清除前后染色球体的直接对比视频 (z-stack of 440 slices at a slice spacing of 0.36 µm)。

　　注：此实验方案来自ibidi的实际用户，更多详情可联系本文作者E-mail address: selina.keppler@tum.de

　　仅供科研使用！

AnielloFederico*,JochenUtikalSkinCancerUnit,GermanCancerResearchCenter(DKFZ),69120Heidelberg,Germany.*Correspondingauthor.E-mailaddress:a.federico@dkfz-heidelberg.de

为了研究肿瘤微环境影响下肿瘤细胞的运动性和侵袭特性，建立了体外2D侵袭方案。这种2D侵袭方案是一种共培养试验，在这种情况下，是由肿瘤和基质细胞（例如成纤维细胞）组成的。一旦两种细胞类型接触，在不同的条件下评估侵袭成纤维细胞单层的肿瘤细胞的数量，在我们的研究中，我们在模拟实体肿瘤微环境中发现的条件，例如与基质细胞（成纤维细胞）的相互作用以及成纤维细胞释放的可溶性因子（Nnetu等，2012）。我们使用A375黑色素瘤细胞系和真pi成纤维细胞进行了此测定。黑色素瘤细胞激活成纤维细胞，继而维持肿瘤细胞的生长，恶性转化和耐药性（Flach等，2011）。然而，在刺激所测试的抗ai化合物后，我们发现与成纤维细胞直接接触的黑素瘤细胞显示出运动能力受损并且未能侵袭成纤维细胞层。

材料和试剂

1. GFP-A375细胞系（ATCC）

2. 番茄皮成纤维细胞（从健康患者中分离）

3. MEF细胞培养基

4.PBS（Sigma-Aldrich；D8537）

5.胰蛋白酶-EDTA溶液（Sigma-Aldrich；T3924）

6. 台盼蓝溶液（Sigma-Aldrich;93595）

7.DMSO（CarlRoth;A994.2），在0.1％最终浓度下使用

8.MithramycinA（BioTrend；10-2085-5mg），在300nm浓度下使用，用DMSO稀释

仪器设备

1. 层流净化罩

2. 12/24孔多孔板（GreinerBio-One）

3. 台式离心机

4. 细胞计数器

5. 2孔插件（ibidi: 80209）/预置2孔插件培养皿（ibidi:81176）

6.细胞培养管

7. 涡旋

8. 镊子

9. 光学显微镜

10. 荧光显微镜

11. NIS-Elements软件

ibidi:81176

实验流程

01. 将GFP-A375和番茄成纤维细胞系稳定地保存在MEF培养基中，在37°C和5%C02加湿培养箱中。

02. 当细胞达到亚融合度（约80％融合度）时，在带有PBS的通风橱中清洗它们，以去除死细胞和碎片。

03. 在培养箱中用胰蛋白酶-EDTA溶液胰蛋白酶消化细胞约5分钟，然后添加MEF培养基以阻止反应。

04. 将细胞悬浮液收集在15ml细胞培养管中，并用台式离心机（1500xg,5´,RT）短暂离心。

05. 将细胞重新悬浮在新鲜培养基中；将一体积的细胞悬液与另一体积的台盼蓝溶液混合，用细胞计数器计数活细胞。

06. 在MEF缓冲液中以4x105细胞/ml的浓度稀释细胞。

07. 在多孔板上，在每个孔的中间放置一个Culture-Insert2孔（2孔培养插件）。

08. 用75µl（3x104细胞）FP-A375细胞填充插入物一侧，并用番茄成纤维细胞填充另一侧。用移液器上下混合插入物中的细胞，以确保细胞完全分布。

09. 将多孔板放在培养箱中，放置过夜。

10. 第二天，在镊子的帮助下，小心地从每孔中取出培养基和插件，并用PBS清洗。

11. 小心除去PBS，然后加入新鲜的MEF培养基。

12. 用光学显微镜检查GPF-A375与Tomto成纤维细胞之间产生的间隙的闭合状态。

13. 一旦每个孔中的间隙完全闭合，请使用荧光显微镜和成像软件获取荧光图像。确保肿瘤细胞尚未侵入成纤维细胞单层。

14. 小心地除去培养基，并在控制组孔中添加培养基+0.1％PBS，在处理组孔中添加培养基+300nM丝裂霉素A。将板放在培养箱中24小时（处理孵育时间）。

24小时后，在荧光显微镜下重新采集共培养孔，以评估治疗组与对照组（绿色荧光细胞散布在红色标记层上）的肿瘤细胞侵袭行为的任何变化（图2）。

图1：2D侵袭系统的示意图

图2：2D侵袭检测的荧光图像

将黑素瘤细胞和成纤维细胞共培养，然后暴露于300nmMithramycinA（或DMSO）。24小时后，评估侵袭成纤维细胞层的肿瘤细胞的数目。A375细胞显示出大规模的侵袭行为，受到MithramycinA治疗的损害。比例尺：500μm。

备注：

1.此处描述了MEF培养基组成（参考文献1）。

2.此文仅供参考。

3.此实验方案来自ibidi的实际用户，更多详情可联系本文作者。

参考文献：

1.MithramycinAandmithralogEC-8042inhibitSETDB1expressionanditsoncogenicactivityinmalignantmelanoma. FedericoA,SteinfassT,LarribèreL,NovakD,MorísF,NúñezLE,UmanskyV,UtikalJ.MolelucarTherapy-Oncolytics2020;doi: https://doi.org/10.1016/j.omto.2020.06.001 (Methoddescribedinthisprotocolwasincludedinthispublishedarticle).

2.Theimpactofjammingonboundariesofcollectivelymovingweak-interactingcells. NnetuKD,KnorrM,KäsJ,ZinkM.NewJournalofPhysics2012;doi:https://doi.org/10.1088%2F1367-2630%2F14%2F11%2F115012

3.Fibroblastscontributetomelanomatumorgrowthanddrugresistance. FlachEH,RebeccaVW,HerlynM,SmalleyKS,AndersonAR.Molecular pharmaceutics2011;doi:10.1021/mp200421k

　　该应用描述了一种在流动下的粘附试验，该试验旨在研究特定细胞表面分子的作用，以确定它们在细胞附着和粘附到其他细胞类型期间的潜在相互作用。

　　对于我们的方法，我们使用预染色的鼠肿瘤细胞（多发性骨s瘤：MM）和鼠内皮细胞（EC），然后使用单克隆抗体阻断我们感兴趣的分子之一。简而言之，将EC接种到ibidi通道μ-SlidesI0.6mmLuer中，并在恒流下培养24小时。为了开始共培养，将标记的MM细胞添加到流动容器中并继续流动。24小时后，用抗体（以阻断感兴趣的分子）或相应的同种型对照处理装置，并保持流动24小时。第二天，将μ-Slides与流体单元(FU)断开并清洗以去除非粘附的MM细胞。为了分析标记的MM细胞对EC的粘附，使用共聚焦显微镜获得了μ-Slides的荧光图像。

　　1. 材料和试剂

　　•MOPC多发性骨s瘤(MM)细胞系(ATCC,TIB-23™)

　　•EOMA内皮细胞(EC)系(ATCC,CRL-2586™)

　　•含10%FCS的RPMI培养基（FisherScientific，11530586）

　　•内皮细胞生长培养基（EC培养基、CellBiologics、M1168）

　　•PBS（泛生物技术，P04-361000）

　　•非酶细胞解离溶液（Sigma-Aldrich，C5914-100ML）

　　•台盼蓝溶液（Sigma-Aldrich，93595）

　　•CellTracker™绿色CMFDA染料（ThermoFisher，C7025）

　　2. 设备和设置

　　•带有2个流体单元(FU)的ibidi泵系统，每个单元都带有用于2ml储液罐的支架（ibidi，10977）

　　•ibidiμ-SlideI0.6mmLuer，ibiTreat（ibidi，80186）

　　•ibidiPerfusionSet蓝色，15厘米，内径0.8毫米（ibidi，10961）

　　•ibidi过滤器/储液罐套装，2毫升（ibidi，10972）

　　•带细胞培养设备的层流罩

　　•培养箱（所有培养步骤均在37°C和5%CO2下进行）

　　•带有适当滤光片组和照相机的荧光显微镜

　　•粘度：0.0072(dynxs)/cm²

　　3.实验流程

　　1.准备EOMA细胞稀释液：根据制造商的说明，使用非酶细胞解离溶液分离先前培养的EOMA细胞。使用血细胞计数器（Neubauerchamber）对细胞进行计数。在EC培养基中将细胞稀释至1.2x106个细胞/ml的浓度。

　　2.种入EOMA细胞：在3个 µ-SlidesI0.6mmLuer（ibidi，80186）中加入150µlEOMA细胞稀释液（每个µ-Slide1.75x105EOMA细胞），然后孵育3小时。

表1：实验设置

　　3.启动流量：播种三小时后，将2个µ-Slides连接到流体单元FU，使用总量2.7毫升EC培养基。在8.2mbar的压力下将EOMA细胞表面的剪切应力设置为0.5dyn/cm²。测量流速并使用两个FU的平均值来计算校准因子。提前孵育FU和连接的载玻片过夜。第三个带有EOMA细胞的µ-Slide用作静态控制。在没有任何流动的情况下孵育它过夜。

　　4.准备MM细胞：根据制造商的方案，用CellTrackerGreen(CMFDA)染料在600µlRPMI培养基（不含FCS）中染色6x105MM细胞。标记后，离心细胞并使用血细胞计数器对其进行计数。

　　5.开始与MM细胞共培养：停止流动并在无菌条件下从FU水库中取出EC培养基。要开始共培养，将RPMI培养基（含10%FCS）和EC培养基以1:1的比例混合，并填充该混合物总体积为2.5ml，其中含有1.5x105MM注入两个FU储液罐。将FU重新连接到泵系统并继续流动24小时。

　　6.分子阻断：将MM细胞添加到ECs后24小时，用100µg/ml抗体（载玻片 #2）或相应的同种型对照（载玻片 #1）处理细胞，将它们直接添加到FU，无需更换介质。将孵育保持在流动状态下24小时。

　　7.清洗和成像：从FU上断开µ-Slides。用PBS清洗细胞一次，以去除任何非贴壁细胞。使用共聚焦显微镜获取荧光图像，以可视化附着在EC层上的标记MM细胞。

图1：与同种型对照处理（左图）相比，阻断特定表面分子（右图）时，MM细胞对ECs的粘附性降低

1、Culture-Inserts插件可以重复使用吗？

尽管 Culture-Inserts 插件中的材料可高压灭菌并且与酒精相容，但我们不建议重复使用。 如果您仍想尝试重复使用，则需要建立一个用酸或碱的清洁程序。 ibidi没有任何清洁Culture-Inserts插件的经验，虽然它们可能会保持粘性，但之前实验的残留可能会影响重现性。 

2、可否在盖玻片上使用 Culture-Inserts插件吗？

可以，您可以在任何盖玻片上使用 Culture-Inserts插件。 到目前为止，还没被报告与任何干燥表面不相容。 

3、是否可以使用 Culture-Insert 插件制作小于 500 µm 的伤口？

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不可以，Culture-Inserts 插件中最小和标准的伤口尺寸是 500 µm。 Culture-Insert 4 Well /4孔插件会有一个额外的中心间隙，伤口大小为 1000 µm。

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4、Culture-Insert 插件是如何固定在培养皿上的？

Culture-Insert 插件由生物相容的硅胶材料制成。 硅胶底部有一个粘性表面，可粘附（粘）在任何平坦、干燥、均匀的表面。 这种材料足够柔软可粘到表面上。 您可以用无菌镊子按压插件来简单地修复它。

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 5、您是否曾经遇到过 Culture-Inserts 插件无法粘附在定制涂层表面上的问题？

只要表面干燥，我们从未遇到过让 Culture-Inserts 插件粘附在定制涂层表面上的任何问题。 但是，潮湿的表面会导致泄漏。 因此，请确保您的定制涂层表面完全干燥。

6、需要在 Culture-Insert 插件中播种多少个细胞才能进行细胞迁移实验？

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开始迁移实验时，Culture-Insert 插件中的细胞层应融合。 在所有实验中，汇合细胞层的密度应尽可能一致。 使用的接种细胞数量取决于您的细胞类型，因此您可以在 Culture-Insert 2 Well 说明书中找到推荐的范围和详细方案。 

7、为什么移除 ibidi Culture-Insert 插件后细胞有时会从盖玻片上脱落？

以下是解释细胞脱离的一些可能原因：

• 细胞密度太高。 --> 播种更少的细胞（细胞层应在 24 小时后生长至 100% 融合，但不能过度生长）。有关伤口愈合试验的详细方案，请参阅：伤口愈合／细胞划痕实验新方法－如何划出笔直均一的划痕（这是个链接2020-12-10发布的公众号）

• 细胞正在挨饿。 --> 增加每个插入孔的培养基体积，或在细胞生长期间更换培养基。

• 在极少数情况下，细胞类型不能很好地粘附在 ibiTreat 表面。 --> 首先，覆盖盖玻片表面以促进细胞附着。然后，在插入 ibidi Culture-Insert 插件之前让涂层干燥。

以下是使用带有涂层的 ibidi Culture-Inserts 插件以促进细胞粘附的一些额外提示：

• 我们强烈建议提前测试移除ibidi Culture-Insert 插件是否会破坏迁移间隙中的涂层。这可以通过使用针对涂层蛋白的荧光标记抗体进行分析。如果迁移间隙区域中涂层的荧光信号与开放孔中的一样均匀和强烈，则可以假设在插入物移除后是保持完好的。经过几次成功的测试后进行实际实验通常是安全的。

• 如果去除插入物破坏了大部分涂层，则仅涂覆插件的孔，然后接种细胞。取出插件后，通过向培养基中添加低浓度涂层来填充间隙并孵育约 30 分钟。之后，用普通介质替换涂层溶液并继续进行迁移实验。

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8、当 Culture-Insert变干燥时，包被蛋白会失去活性吗？

这主要取决于与 Culture-Insert 插件一起使用的蛋白质类型。 使用层粘连蛋白的人通常更喜欢在涂层和细胞接种之间保持水分。 根据我们的经验，当纤连蛋白和胶原蛋白 IV 干燥时，我们没有发现对细胞迁移速度有任何影响。 

9、有没有办法用悬液细胞进行伤口愈合实验，或者该实验仅适用于贴壁细胞？

目前，使用 Culture-Insert插件的伤口愈合实验只能用于贴壁细胞。 然而，单个细胞的迁移研究可以在 µ-Slide 趋化性中通过将细胞嵌入到3D基质（例如，I 型胶原蛋白凝胶）中进行。 

10、是什么使 Culture-Inserts插件在细胞接种过程中不会泄漏？

Culture-Insert 插件由硅胶材料制成。 上部是粗料，下部是非常柔软的材料，在按下 Culture-Insert 插件后会固定在表面上。 正确插入时是不会有任何泄漏的。 

11、该如何存储 Culture-Inserts插件？

请在室温下储存 Culture-Inserts。 打开过的产品应储存在无菌容器中。 

12、有时很难在 Culture-Insert 插件中看到细胞层的汇合。 您有什么建议？

当使用相差显微镜和小孔时，例如 Culture-Insert 插件或 96 孔板，空气-水界面之间的弯月面会导致表面强烈弯曲。 这会破坏除孔中心以外的任何地方的相位对比效应。

一种解决方案是用细胞培养基完全均匀地填充 Culture-Insert 的两个孔。 通过这样做，您可以在孔上方的介质和空气之间创建一个平面。 请记住，这可能会导致两孔之间的交叉污染。

13、有时，细胞倾向于聚集在 ibidi Culture-Insert插件的边缘。 怎样才能避免这种情况？

当细胞在 Culture-Insert插件中生长到非常高的密度时，会观察到了这种情况。 为了减少细胞团块，您应该在实验开始时使用较低的细胞密度。 然而，有时细胞会粘在与细胞相容的硅胶上。 在这种情况下，我们建议较少孵育时间和/或细胞数量。 

14、Culture-Insert 如何在不造成细胞损伤的情况下模拟生理伤口？

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使用体外实验时，很难以可重复的方式模拟生理伤口。 当然，来自死细胞的碎片可能在与伤口愈合相关的迁移中发挥作用。 使用 Culture-Insert插件的 ibidi 伤口愈合实验提供了可重复的、无损伤的细胞贴片。

在体内，各种其他参数对伤口愈合的影响更大，例如不同细胞类型的相互作用。 使用 Culture-Insert插件的体外 ibidi 伤口愈合实验将迁移速度与所有这些其他影响分开，提供了一个客观且可重复的实验环境。

15、用Culture-Insert插件产生间隙时细胞是否会受损？

Culture-Insert 插件将细胞彼此分离，而不会产生传统意义上的伤口（例如，在划痕实验期间）。 目的是在不产生大量受伤细胞的情况下产生间隙，然后研究间隙闭合。该技术使用户能够将细胞的迁移行为与细胞损伤区分开来。 

16、 Culture-Inserts 插件能否用于蛋白质涂层表面？ 拔出 Culture-Insert 插件会干扰涂层吗？

一般来说，只要涂层干燥，Culture-Insert 产检可以放置在涂层表面上。 请注意，插件不会黏附在潮湿的表面上。

但是，我们强烈建议您提前测试插件移除是否会破坏迁移间隙中的涂层。 您可以使用针对涂层蛋白的荧光标记抗体来分析这一点。 如果迁移间隙区域的涂层发出的荧光信号与开放孔中的一样均匀和强烈，那么您可以假设在移除插件后涂层是保持完好的。 经过几次成功的测试后进行实际实验通常是安全的。

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　　细胞划痕实验（Wound Healing)是一种操作简单，经济实惠的研究细胞迁移/肿瘤侵袭的体外试验方法。为了研究细胞迁移的机制，科学家们传统上转向“划痕试验”，它利用移液器尖端在多孔板中的单层细胞上“划痕”，并观察间隙所需闭合的时间（这些有时也被称为“伤口闭合”或“伤口愈合”分析）。这种类型的实验允许分析细胞迁移，并可以用各种药物和化学品来增强，以阐明特定的机制。

　　在 ibidi 35mm µ-Dish 中培养的内皮细胞，预置2-Well Culture-Insert。移除插件后，让细胞迁移 24 小时，然后固定在 4% PFA 中，并进行透化。VE-钙粘蛋白（洋红色）、 F-肌动蛋白用鬼笔环肽（绿色）和细胞核用DAPI（蓝色）的抗体染色，然后进行共聚焦成像。

　　Derek Sung, University of Pennsylvania School of Medicine：

　　我一直都有进行划痕分析。与大多数体外测定类似，一致性是获得准确和可重复结果的关键。作为进行过无数次此实验的人，使用移液器手动创建间隙存在一些过去给我带来麻烦的关键问题。这就是为什么发现 ibidi Culture-Inserts是一种救星。ibidi 细胞培养插件与传统的划痕检测方法相比具有许多优势：

　　1. 标准的间隙距离

　　传统划痕分析和使用移液管手动划痕大挑战之一是间隙距离不一致。而且，划痕往往划不直。因此，起始距离通常会在几十到几百微米之间变化。ibidi 的细胞培养插件中心会产生500 µm 无细胞的人造间隙。这确保了间隙是直的，并且每次的距离都是一致的。

　　2. 干净的迁移边缘

　　手动划痕还会产生未完全去除的自由浮动细胞的问题。这些自由漂浮的细胞可以通过延迟自由边缘的迁移、释放细胞内内容物或重新附着来影响迁移率。ibidi 的细胞培养插件是可移除的，留下干净笔直的边缘。

　　3. Z小化细胞数

　　传统的划痕检测是在多孔板中完成的，需要一层汇合的细胞。如果实验有多种条件（药物治疗或基因操作）并且需要多次重复，这会需要增加大量细胞。对于珍贵或昂贵的细胞（例如从难以获得的组织中分离出的原代细胞），这些实验可能变得难以进行。ibidi 的细胞培养插件具有较小的生长面积，可大限度地减少实验所需的细胞数量（准确地说，每孔0.22 cm 2）。这允许大限度地利用宝贵的细胞或增加重复次数。

　　4. 盖玻片底皿

　　划痕分析通常在多孔板中进行，底部厚，聚苯乙烯，只允许明场成像和间隙距离的量化。ibidi 的细胞培养插件具有经过组织培养处理和灭菌的盖玻片底部。这允许进行明场和免疫荧光成像。就我个人而言，我认为这是该产品好的方面，让我们能够看到如细胞骨架、细胞粘附形态、核形态等结构。此外，多模态成像功能大限度地提高了单个实验的数据量，从而节省了成本和试剂。

　　5. 单个实验的独立插件

　　“边缘效应”是指一种细胞培养现象，其中多孔板外周的孔比内孔经历更多的蒸发，导致不同的条件和潜在的不一致结果。使用多孔板进行划痕检测时可以看到类似的效果，影响结果的一致性和重现性。ibidi 的细胞培养插件单独包装，用于单次实验。这可以防止任何“边缘效应”并确保数据一致。另外，培养皿设计有盖子锁定功能，以确保在处理盘子时盖子保持打开状态。

　　与枪头划痕检测相比，ibidi 伤口愈合插件可提供更高的重现性

　　由于细胞迁移开放区域随时间发生变化。使用 ibidi Culture-Insert 2 孔（左）和用移液器吸头刮擦产生间隙的对比。数据来源：德国弗莱堡大学的 M. Börries。

　　乍一看，枪刮和放置插件的方法似乎是两种非常相似的创建无细胞间隙的方法。 然而，仔细观察，这两种方法可能在重要检测结果方面的影响有所不同：

了解不同生物复杂性水平的疾病过程对于全面了解疾病机制非常关键，想要实现这一目标，就需要以可靠、可重复和具有统计学意义的方法，来获取复杂的生物数据。包括细胞图像分析在内的自动化数据收集方式，在帮助用户获得高质量数据这个方面提供了有力保障。自动化数据收集的另一个优势还在于，可以提高工作流程效率和减少固有的用户偏好。

来自安捷伦的应用开发科学家 Ernest Heimsath 博士和来自 Cell signaling Technology 产品设计与战略高级总监 Antony Wood 博士开展了一项合作，旨在开发自动化高通量的 TGF-β 信号传导检测方法。

近日，他们通过网络研讨会展示了他们的合作成果——将经过严格验证的 CST 免疫分析试剂应用于 Agilent BioTek Cytation C10 共聚焦成像微孔板检测系统上，在 2D 和 3D 细胞模型中定量评估 TGF-β 信号传导的高通量方法。

如果您也在进行信号通路研究，欢迎扫描下方二维码观看本次研讨会的中文回放。

观看回放您将了解到：

免疫分析试剂选择

高通量实验设计与样品制备

2D 和 3D 细胞模型的成像与分析

报告嘉宾：

Ernest Heimsath, PhD

应用开发科学家

安捷伦科技有限公司

Antony Wood, PhD

产品设计与战略高级总监

Cell Signaling Technology, Inc (CST)

　　免疫荧光实验原理

　　免疫荧光(IF)是使用显微镜深入了解细胞结构和过程的有效方法。此方法可评估特定蛋白质的表达和位置，使得免疫荧光成为科学家解决许多细胞生物学问题不可或缺的工具。

　　免疫荧光实验基于以下主要步骤：

　　1.特异性抗体与感兴趣的蛋白质结合。

　　2.荧光染料与这些免疫复合物偶联，以便使用显微镜观察感兴趣的蛋白质。

　　内皮细胞中vWF的免疫荧光染色。肌动蛋白用phalloidin染色(绿色)，细胞核用DAPI染色(蓝色)。

　　区分直接和间接免疫荧光。在直接免疫荧光中，一抗直接偶联到荧光团（也称为荧光色素），便于处理和快速可视化。在间接免疫荧光中，使用特异性结合一抗的二级荧光团偶联抗体来可视化感兴趣的结。

　　尽管di二种方法比直接免疫荧光更耗时，但它有几个显著的优势，比如它通常更便宜，因为二抗可以用于不同的一抗。此外，通过结合多个一抗和特定的二抗(每个抗体都用不同的荧光团标记)，可以在单个样品中平行特异地显示多个蛋白质(多色免疫荧光)。

　　免疫荧光染色:典型的工作流程

　　每个免疫荧光染色方案由培养、固定、染色、成像四个主要步骤组成，可细分如下:

　　免疫荧光染色是一种非常敏感的方法，可能需要排除故障《免疫英冠染色故障排除指南》。方案中的微小变化可能会导致不同的结果，而这些结果不再具有可比性。因此，在您的特定方案中精确地保持完全相同的条件是非常重要的(例如，细胞密度、抗体稀释度、培养温度和培养时间)。

　　免疫荧光实验方案对比

　　传统染色与ibidi方案染色

　　当使用任何ibidi解决方案时，ibidi的免疫荧光染色方案比传统方案要简便快速的多。无需在松散的盖玻片上生长细胞，细胞可直接在ibidi玻片上生长和染色。

　　用于免疫荧光应用的各种ibidi产品

　　更多ibidi相关产品的免疫荧光实验应用可查阅我们雷萌公众号相关文章！

　　参考文献

　　K.G. Zyner, A. Simeone, S.M. Flynn, et al. G-quadruplex DNA structures in human stem cells and differentiation. Nat Commun, 2022, 10.1038/s41467-021-27719-1

　　C. Xu, et al. NPTX2 promotes colorectal cancer growth and liver metastasis by the activation of the canonical Wnt/beta-catenin pathway via FZD6. Cell Death & Disease, 2019, 10.1038/s41419-019-1467-7

　　Kobayashi, T., et al. Principles of early human development and germ cell program from conserved model systems. Nature, 2017, 10.1038/nature22812

　　H. Tada et al. Porphyromonas gingivalis Gingipain-Dependently Enhances IL-33 Production in Human Gingival Epithelial Cells. PloS one, 2016, 10.1371/journal.pone.0152794

　　Read article

　　1.介绍

　　ibidi泵系统/流体剪切力系统是专为灌注条件下的长期细胞调节而设计。标准方法是将一个载玻片连接到一个灌注装置。在某些情况下，增加载玻片（细胞）的数量可能是有用的。例如，当计划进行各种染色时，或者如果细胞数量对于后续的应用（如FACS）不够时。

　　本应用是一个循序渐进依次连接µ-Slide VI0.4六通道载玻片的实验方案。

　　重要提示！

　　串联的通道承受着几乎相同的流速，因此剪切应力也几乎相同。

　　我们强力建议串联通道载玻片，而不是并联！

　　我们建议按所述方式连接不要超过两个µ-Slide VI0.4 六通道载玻片

　　2.材料

　　对于设置，需要以下材料(无菌):

　　* 串联连接管(ibidi #10830)，5 pieces

　　* 细胞培养基

　　* 接种了细胞的ibidi µ-Slide VI 0.4

　　* 灌流管

　　* 1 ml注射器

　　* 软管夹

　　* 移液吸头

　　重要提示！

　　将串联连接管、细胞培养基、通道载玻片和灌注装置在培养箱中平衡一整晚!

　　本方案的所有步骤都应在无菌条件下完成!

　　3.准备工作

　　整个设置相当于只有一个通道的标准实验。 区别是，在将整个组件连接到Perfusion Set之前，先将多个通道串行连接起来。

　　3.1.接种细胞

　　像往常一样在µ-Slide VI 0.4的通道中接种细胞。如果需要进一步的静态培养，让细胞附着并在附着后用60µl无细胞培养基填充储液池。详细说明见“使用ibidi流体剪切力系统培养内皮细胞实验方法汇总”。细胞贴壁后，就可以进行载玻片的串连了。

　　3.2.泵设置

　　按照“使用ibidi流体剪切力系统培养内皮细胞实验方法汇总”中的说明准备泵的设置。向灌流管的储液池中各注入5ml平衡介质，并以中压(约50mbar)运行泵，去除气泡。

　　重要提示！

　　将公鲁尔接头连接到母鲁尔接头时，务必小心不要带进气泡。

　　尽可能快地工作，以避免载玻片和细胞冷凝。整个过程必须在10分钟内完成。

　　4.串联连接

　　通道的串联连接是在细胞贴壁后和将载玻片连接到灌注管之前完成。

　　按照第3部分的描述准备载玻片，接种细胞并贴壁        如图所示，将五个串行连接管连接到Luer端口

　　用无细胞培养基填充注液孔，直到所有注液孔完全充满    在此步骤中，注意注液孔底部不能有气泡

　　注意不能在注液孔中留有气泡

　　用1ml的无菌注射器吸满培养基，小心插入如图的孔中，不要引入气泡。

　　小心慢慢注入培养基，直到第一个串联管有培养基微微冒出

　　小心的将串联管弯过来，插入相邻的Luer端口中。不要产生气泡。

　　继续推动注射器，直到第二根串联管也被充满，继续推动注射器充满下一根串联管。

　　重复上面的操作，继续充满所有的通道和串联管。

　　将所有的串联管连接好后，将加满液体排除气泡的灌流管用软管夹夹住。

　　从灌流管的母鲁尔锁定耦合器中拔出公鲁尔接头，并将其插入载玻片上末尾一个Luer端口中。在慢慢抽出注射器，用新鲜的培养基填满Luer端口并去除气泡

　　从灌流管的母鲁尔锁定耦合器中拔出第二个公鲁尔接头，并将其插入载玻片上另一端末尾的Luer端口

　　设置完成，可开始启动实验。别忘了取下软管夹！

　　串联灌流系统搭建完成。

　　5.调整流速

　　软件中无法预见多个通道载玻片的设置。需要调整泵的参数以适应新的要求。作为指南您可以在软件中选定正在使用是µ-Slide VI0.4通道载玻片。由此产生的流速(以及剪切应力)将低于在单通道的应用中。用所需的剪切应力启动一个循环，手动测量流速(ibidi Pump Instructions, page 40（可联系我们索要电子版文档）)。然后进入重新校准对话框，输入计算的（软件给定的流速）和测量的流速。

　　细胞生物学是生命科学的一门学科。顾名思义，它致力于研究生物。单凭这一事实就足以成为研究细胞自然生存状态的理由。当然，活细胞成像还有其他深层次的原因。在本篇文章中，我们列举了用延时显微镜研究活细胞是有意义的五大很好的理由。

　　背景

　　活细胞成像允许在一定时间内在显微镜下对细胞进行体内观察。各种显微镜技术适用于活细胞成像：例如，可以采用无标记的技术，如相差，DIC，或干涉测量法，也可以依靠荧光显微镜，利用荧光标记标记和可视化细胞亚结构、分子或蛋白质。当然，活细胞成像也面临挑战，在建立活细胞图像实验时需要考虑某些要求。最重要的是，必须确保显微镜配备了一个stage top 培养箱，能够提供理想的环境，使细胞在一段时间内保持存活和健康。

图1.A：活细胞成像过程中需要考虑和控制的环境参数

图1.B：倒置显微镜的台顶培养箱示意图

　　参数和环境条件是此类实验的重要部分，我们将在以后的公众号中讨论。如果您有兴趣，可以在本篇文章中查看更多相关内容。在此我们已经介绍了基本知识，接下来我们将继续深入探讨为什么您应该使用活细胞成像来研究您的细胞：

　　1.避免固定过程中的人工制品

　　细胞通常在显微镜观察前固定（如免疫荧光），以保存在逼真的状态。多年来，许多不同的化学和物理程序已被优化和建立，以保持原始样品的质量。然而，固定过程会对细胞造成损害（当然在这个过程之后，它们会死亡），并不可逆转地改变其组织、结构和形态（细胞器收缩、蛋白质定位错误等）。然而，活细胞成像可以让我们研究活细胞。这意味着他们应该展示他们的自然形态，这仍然会受到荧光标签、激光等的影响，但这就像环境条件一样，是一个不同的状况。

　　2.观察和分析动态过程

　　活细胞成像使我们能够观察整个细胞群、单个细胞甚至亚细胞水平的动态事件。当固定细胞将其锁定在特定时间点的特定（行为或结构）状态时，对活细胞的显微镜观察可以洞察整个动态过程。基于功能性细胞的检测，如损伤和迁移（图2）或趋化实验是活细胞成像应用的很好的例子。这些分析使得研究细胞对化学（趋化性）或机械（伤口愈合）刺激的反应成为可能。

图2：使用ibidi Stage Top孵育系统的活细胞成像显示了伤口愈合和迁移试验中MCF7细胞的间隙闭合。相差；10倍物镜。

　　3.实时跟踪细胞变化

　　活细胞显微镜是实时了解细胞随时空变化的一种有价值的方法，而不是依赖于固定细胞的端点的分析结果。通过使用延时视频显微镜对细胞进行更长时间的跟踪，可以捕捉到结构重排的动态(如图3，感受趋化刺激后细胞骨架的极化), 或使用固定细胞可能会错过的瞬时细胞性活动(如，有丝分裂期间的染色体分离)。

图3：应用趋化梯度后，表达LifeAct的原代树突状小鼠细胞中肌动蛋白动力学的活细胞成像

　　4. 研究单分子动力学、定位和相互作用

　　先进荧光标记和成像技术的发展，如光脱色荧光恢复技术（FRAP）、荧光寿命成像显微技术（FLIM）和荧光共振能量转移技术（FRET），使活细胞成像过程中单分子定位、动力学和相互作用的观察和分析成为可能。

　　FRAP可以测量活细胞内荧光标记分子和蛋白质的迁移率。FLIM通过测量附着的荧光团的寿命来提供有关细胞分子分布及其环境的信息。

　　利用FRET，人们可以通过检测两个分子在纳米级相互接近时所附荧光团的相互作用来测量活细胞中两个分子的直接相互作用。

　　5. 从单个实验中获取更多信息

　　总的来说，如果您进行活细胞成像，您可以从单个实验中获得比从固定细胞成像更多的信息。这是因为活细胞成像使人们能够跟踪分子动力学和动力学，并提供了您感兴趣的一个更大、更全面的细胞过程图像。

　　对固定样本的分析通常只提供某个细胞性活动的快照，而跟踪整个动态过程使人们能够从单个实验中测量更多参数，并得出更多不同的结论。

　　如您有兴趣了解更多关于活细胞成像的知识，请关注我们公众号活细胞成像应用相关内容。也可以向我们索要相关资料。

　　活细胞成像应用相关内容：

　　1、哪种细胞密度最适合我的实验？

　　通常，我们建议每孔使用5,000-10,000个HUVEC。 但是，确定最佳细胞数对于使用µ-Slide血管生成从管形成测定中获得最佳结果是至关重要。 细胞密度取决于细胞类型和细胞大小。 因此，在开始实际实验之前，我们建议在非抑制条件下播种几个细胞数并对管形成进行成像。 然后，对于最佳测定条件，使用在您的实验中产生最多管数的细胞密度。请记住，细胞通常不会在凝胶基质上增殖。请参阅：血管生成实验实验装置优化和数据分析 |ibidi µ-Slide

　　2、应该在哪个时间段内观察细胞？

　　管形成的持续时间取决于细胞类型和所使用的细胞外基质，应单独确定。 通常，HUVEC在 2-4小时后已经形成管。24小时后细胞开始发生凋亡，这导致从基质中脱离和管破裂。请参阅：血管生成实验实验装置优化和数据分析 |ibidi µ-Slide

　　3、是否需要活细胞成像装置来每小时拍摄管形成测定的照片？

　　非必须，通过显微镜对 µ-Slide 血管生成上的同一位置进行一致和精确的成像。 可以使用显示 x/y 坐标的显微镜载物台或自动载物台来完成成像。 使用自动化平台，可以将孔的所有位置（特别是每个孔的中心）保存到位置列表中，您可以在每个时间点访问相应的位置。

　　但是，使用完整的活细胞成像设置在显微镜上建立生理条件要方便得多。使用ibidi Stage Top 孵育系统等活细胞孵育装置有助于在成像过程中提供稳定温度和湿度条件，从而在体外可以直接进行视频拍摄。

　　4、是否可以使用 µ-Slide 血管生成在凝胶基质内培养细胞？

　　可以，µ-Slide 血管生成非常适合在精确定义的3D基质中培养细胞。由于大界面的凝胶和顶部细胞培养基，凝胶中的条件可以通过更换上部储液器中的介质来调整。

　　5、应该在管形成实验中使用含酚红的凝胶还是不含酚红的凝胶？

　　对于使用µ-Slide血管生成的管形成测定中的相差显微镜，酚红不会干扰图片，并且由于其颜色，处理更容易。然而，当使用荧光显微镜时，酚红可能会干扰探头的波长。在这种情况下，应该使用无酚红凝胶。

　　6、是否需要将µ-Slide Angiogenesis血管生成载玻片放入培养箱的湿室中进行凝胶聚合？

　　我们建议将µ-Slide血管生成载玻片放入加湿腔中进行凝胶聚合。 虽然反应室对于聚合本身不是必需的，但它可以最大限度地减少蒸发的影响。 在高流量孵化器中，防止蒸发的足够百分比的湿度可能不会始终保持一致。 µ-Slide血管生成中的少量凝胶会很快变干，这会导致弯液面的形成。

　　7、胎牛血清 (FBS) / 胎牛血清 (FCS) 浓度是否会影响管形成实验中的管形成和降解速率？

　　一般是的。 这取决于所使用的细胞类型或细胞系。 当提供浓度高达 10% FCS 的细胞培养基时，我们在 µ-Slide 血管生成中观察到典型的原代细胞 (HUVEC) 管形成和 Matrigel® 上的几种内皮细胞系。 但是，我们建议分别优化每个细胞系的 FBS/FCS 浓度。

　　8、您是否推荐使用减少生长因子的 Matrigel® 进行管形成分析？

　　对于使用µ-Slide血管生成的管形成测定，我们使用了减少生长因子的 Matrigel® 和未减少的 Matrigel®。请参阅：肿瘤学必备 | 血管生成实验介绍

　　9、我们希望使用减少了生长因子的 Matrigel® 和无血清培养基以及 50 ng/ml VEGF。 这足以刺激管的形成吗？

　　可以，这种组合足以刺激ibidi血管生成实验室器皿中的管形成，而培养基中没有任何额外的生长因子。

　　10、除了 Matrigel® 之外，您在试管形成实验中是否有使用其他凝胶的经验？

　　原则上，任何凝胶都可用于µ-Slide血管生成管形成实验。 细胞可以附着在表面上是很重要的。 胶原蛋白、纤连蛋白和层粘连蛋白为细胞粘附提供了重要的结合基序。

　　11、什么是管形成实验合适的阳性和阴性对照？

　　建议使用阳性和阴性对照来减少管形成实验中的变量。阳性对照是预期细胞在其中形成血管的样本（取决于实验设置），从而向研究人员表明该实验已正确进行。阴性对照是与所有其他样品以相同方式处理的样品，但预计不会显示任何实验结果（例如，很少或没有管形成）。

　　ibidi血管生成实验室器皿中管形成实验的最佳阳性和阴性对照很大程度上取决于所使用的细胞、凝胶基质和一般实验设置。因此，我们建议您查阅文献，了解您感兴趣的主题中成功使用的对照（阳性和阴性对照）。

　　在下文中，您可以找到管形成测定中阳性和阴性对照的可能方法：

　　如果需要分析特定化合物诱导血管生成的效力，则可以使用用已知血管生成诱导剂（例如 VEGF 或 FGF2）处理的样品作为阳性对照。浓度很大程度上取决于细胞类型和实验设置。

　　如果使用原代细胞，预筛选的内皮细胞系（例如，HUVEC）在用特定生长因子处理后表现出明确的反应，可以作为阳性对照。

　　对于某些细胞类型，形成管的能力还取决于所使用的凝胶基质。作为阳性对照，内皮细胞应在含有饥饿培养基（不含生长因子或血清的培养基）的生长因子减少的 Matrigel®上显示管形成。如果需要测试促血管生成物质，则使用饥饿培养基尤其重要，因为大多数细胞培养基都添加了生长因子。为了分析物质的真实效果，基质和培养基都必须不含任何生长因子。作为阴性对照，细胞可以播种在不同的基质（例如胶原蛋白 I）上，预计不会形成管状。

　　不影响细胞活力的管形成抑制剂（例如，苏拉明或萝卜硫素）可用作阴性对照。如果实验的目的是测试抗血管生成物质，则使用这种类型的抑制剂尤其重要。

　　如果用任何溶解的物质（例如，在 DMSO 或乙醇中）处理细胞，则仅使用溶剂作为阴性对照。

　　12、是否有用于分析管形成实验的推荐染色方案？

　　一般来说，相差显微镜足以自动分析 µ-Slide血管生成中的标准管形成实验。 但是，如果您想研究某种标记，您可以应用您的标准方案（例如，用于免疫荧光染色），但要小心，以免损坏凝胶基质或细胞网络。

　　使用calcein的染色方案示例可参阅：肿瘤学必备 | 血管生成实验介绍

　　13、在开始实验之前，我是否必须将 ibidi 血管生成实验室器皿平衡到 37°C？

　　不，不需要平衡 µ-Slide 血管生成。 在室温下储存，可以立即用凝胶基质填充。 由于µ-Slide 的开孔形式，加热时从凝胶中逸出的气体可以与大气自由交换。

　　14、完成实验后，µ-Slide Angiogenesis和µ-Plate Angiogenesis 96 Well可以重复使用吗？

　　不可以，µ-Slide血管生成载玻片和µ-Plate血管生成96孔板是一次性耗材，仅供一次性使用。

　　15、µ-Slide 血管生成是否有96孔版的？

　　有。 µ-Plate血管生成96孔板具有与µ-Slide血管生成相同的“孔中孔”设计和凝胶体积 (10 µl)。 µ-Plate血管生成96孔可用作高通量管形成实验的筛选板，具有完全的ANSI/SLAS (SBS) 和robotics兼容性。