ibidi科普知识系列|血管生成实验小常识

　　1、哪种细胞密度最适合我的实验？

　　通常，我们建议每孔使用5,000-10,000个HUVEC。 但是，确定最佳细胞数对于使用µ-Slide血管生成从管形成测定中获得最佳结果是至关重要。 细胞密度取决于细胞类型和细胞大小。 因此，在开始实际实验之前，我们建议在非抑制条件下播种几个细胞数并对管形成进行成像。 然后，对于最佳测定条件，使用在您的实验中产生最多管数的细胞密度。请记住，细胞通常不会在凝胶基质上增殖。请参阅：血管生成实验实验装置优化和数据分析 |ibidi µ-Slide

　　2、应该在哪个时间段内观察细胞？

　　管形成的持续时间取决于细胞类型和所使用的细胞外基质，应单独确定。 通常，HUVEC在 2-4小时后已经形成管。24小时后细胞开始发生凋亡，这导致从基质中脱离和管破裂。请参阅：血管生成实验实验装置优化和数据分析 |ibidi µ-Slide

　　3、是否需要活细胞成像装置来每小时拍摄管形成测定的照片？

　　非必须，通过显微镜对 µ-Slide 血管生成上的同一位置进行一致和精确的成像。 可以使用显示 x/y 坐标的显微镜载物台或自动载物台来完成成像。 使用自动化平台，可以将孔的所有位置（特别是每个孔的中心）保存到位置列表中，您可以在每个时间点访问相应的位置。

　　但是，使用完整的活细胞成像设置在显微镜上建立生理条件要方便得多。使用ibidi Stage Top 孵育系统等活细胞孵育装置有助于在成像过程中提供稳定温度和湿度条件，从而在体外可以直接进行视频拍摄。

　　4、是否可以使用 µ-Slide 血管生成在凝胶基质内培养细胞？

　　可以，µ-Slide 血管生成非常适合在精确定义的3D基质中培养细胞。由于大界面的凝胶和顶部细胞培养基，凝胶中的条件可以通过更换上部储液器中的介质来调整。

　　5、应该在管形成实验中使用含酚红的凝胶还是不含酚红的凝胶？

　　对于使用µ-Slide血管生成的管形成测定中的相差显微镜，酚红不会干扰图片，并且由于其颜色，处理更容易。然而，当使用荧光显微镜时，酚红可能会干扰探头的波长。在这种情况下，应该使用无酚红凝胶。

　　6、是否需要将µ-Slide Angiogenesis血管生成载玻片放入培养箱的湿室中进行凝胶聚合？

　　我们建议将µ-Slide血管生成载玻片放入加湿腔中进行凝胶聚合。 虽然反应室对于聚合本身不是必需的，但它可以最大限度地减少蒸发的影响。 在高流量孵化器中，防止蒸发的足够百分比的湿度可能不会始终保持一致。 µ-Slide血管生成中的少量凝胶会很快变干，这会导致弯液面的形成。

　　7、胎牛血清 (FBS) / 胎牛血清 (FCS) 浓度是否会影响管形成实验中的管形成和降解速率？

　　一般是的。 这取决于所使用的细胞类型或细胞系。 当提供浓度高达 10% FCS 的细胞培养基时，我们在 µ-Slide 血管生成中观察到典型的原代细胞 (HUVEC) 管形成和 Matrigel® 上的几种内皮细胞系。 但是，我们建议分别优化每个细胞系的 FBS/FCS 浓度。

　　8、您是否推荐使用减少生长因子的 Matrigel® 进行管形成分析？

　　对于使用µ-Slide血管生成的管形成测定，我们使用了减少生长因子的 Matrigel® 和未减少的 Matrigel®。请参阅：肿瘤学必备 | 血管生成实验介绍

　　9、我们希望使用减少了生长因子的 Matrigel® 和无血清培养基以及 50 ng/ml VEGF。 这足以刺激管的形成吗？

　　可以，这种组合足以刺激ibidi血管生成实验室器皿中的管形成，而培养基中没有任何额外的生长因子。

　　10、除了 Matrigel® 之外，您在试管形成实验中是否有使用其他凝胶的经验？

　　原则上，任何凝胶都可用于µ-Slide血管生成管形成实验。 细胞可以附着在表面上是很重要的。 胶原蛋白、纤连蛋白和层粘连蛋白为细胞粘附提供了重要的结合基序。

　　11、什么是管形成实验合适的阳性和阴性对照？

　　建议使用阳性和阴性对照来减少管形成实验中的变量。阳性对照是预期细胞在其中形成血管的样本（取决于实验设置），从而向研究人员表明该实验已正确进行。阴性对照是与所有其他样品以相同方式处理的样品，但预计不会显示任何实验结果（例如，很少或没有管形成）。

　　ibidi血管生成实验室器皿中管形成实验的最佳阳性和阴性对照很大程度上取决于所使用的细胞、凝胶基质和一般实验设置。因此，我们建议您查阅文献，了解您感兴趣的主题中成功使用的对照（阳性和阴性对照）。

　　在下文中，您可以找到管形成测定中阳性和阴性对照的可能方法：

　　如果需要分析特定化合物诱导血管生成的效力，则可以使用用已知血管生成诱导剂（例如 VEGF 或 FGF2）处理的样品作为阳性对照。浓度很大程度上取决于细胞类型和实验设置。

　　如果使用原代细胞，预筛选的内皮细胞系（例如，HUVEC）在用特定生长因子处理后表现出明确的反应，可以作为阳性对照。

　　对于某些细胞类型，形成管的能力还取决于所使用的凝胶基质。作为阳性对照，内皮细胞应在含有饥饿培养基（不含生长因子或血清的培养基）的生长因子减少的 Matrigel®上显示管形成。如果需要测试促血管生成物质，则使用饥饿培养基尤其重要，因为大多数细胞培养基都添加了生长因子。为了分析物质的真实效果，基质和培养基都必须不含任何生长因子。作为阴性对照，细胞可以播种在不同的基质（例如胶原蛋白 I）上，预计不会形成管状。

　　不影响细胞活力的管形成抑制剂（例如，苏拉明或萝卜硫素）可用作阴性对照。如果实验的目的是测试抗血管生成物质，则使用这种类型的抑制剂尤其重要。

　　如果用任何溶解的物质（例如，在 DMSO 或乙醇中）处理细胞，则仅使用溶剂作为阴性对照。

　　12、是否有用于分析管形成实验的推荐染色方案？

　　一般来说，相差显微镜足以自动分析 µ-Slide血管生成中的标准管形成实验。 但是，如果您想研究某种标记，您可以应用您的标准方案（例如，用于免疫荧光染色），但要小心，以免损坏凝胶基质或细胞网络。

　　使用calcein的染色方案示例可参阅：肿瘤学必备 | 血管生成实验介绍

　　13、在开始实验之前，我是否必须将 ibidi 血管生成实验室器皿平衡到 37°C？

　　不，不需要平衡 µ-Slide 血管生成。 在室温下储存，可以立即用凝胶基质填充。 由于µ-Slide 的开孔形式，加热时从凝胶中逸出的气体可以与大气自由交换。

　　14、完成实验后，µ-Slide Angiogenesis和µ-Plate Angiogenesis 96 Well可以重复使用吗？

　　不可以，µ-Slide血管生成载玻片和µ-Plate血管生成96孔板是一次性耗材，仅供一次性使用。

　　15、µ-Slide 血管生成是否有96孔版的？

　　有。 µ-Plate血管生成96孔板具有与µ-Slide血管生成相同的“孔中孔”设计和凝胶体积 (10 µl)。 µ-Plate血管生成96孔可用作高通量管形成实验的筛选板，具有完全的ANSI/SLAS (SBS) 和robotics兼容性。

1、Culture-Inserts插件可以重复使用吗？

尽管 Culture-Inserts 插件中的材料可高压灭菌并且与酒精相容，但我们不建议重复使用。 如果您仍想尝试重复使用，则需要建立一个用酸或碱的清洁程序。 ibidi没有任何清洁Culture-Inserts插件的经验，虽然它们可能会保持粘性，但之前实验的残留可能会影响重现性。 

2、可否在盖玻片上使用 Culture-Inserts插件吗？

可以，您可以在任何盖玻片上使用 Culture-Inserts插件。 到目前为止，还没被报告与任何干燥表面不相容。 

3、是否可以使用 Culture-Insert 插件制作小于 500 µm 的伤口？

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不可以，Culture-Inserts 插件中最小和标准的伤口尺寸是 500 µm。 Culture-Insert 4 Well /4孔插件会有一个额外的中心间隙，伤口大小为 1000 µm。

3的图片

4、Culture-Insert 插件是如何固定在培养皿上的？

Culture-Insert 插件由生物相容的硅胶材料制成。 硅胶底部有一个粘性表面，可粘附（粘）在任何平坦、干燥、均匀的表面。 这种材料足够柔软可粘到表面上。 您可以用无菌镊子按压插件来简单地修复它。

4的图片

 5、您是否曾经遇到过 Culture-Inserts 插件无法粘附在定制涂层表面上的问题？

只要表面干燥，我们从未遇到过让 Culture-Inserts 插件粘附在定制涂层表面上的任何问题。 但是，潮湿的表面会导致泄漏。 因此，请确保您的定制涂层表面完全干燥。

6、需要在 Culture-Insert 插件中播种多少个细胞才能进行细胞迁移实验？

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开始迁移实验时，Culture-Insert 插件中的细胞层应融合。 在所有实验中，汇合细胞层的密度应尽可能一致。 使用的接种细胞数量取决于您的细胞类型，因此您可以在 Culture-Insert 2 Well 说明书中找到推荐的范围和详细方案。 

7、为什么移除 ibidi Culture-Insert 插件后细胞有时会从盖玻片上脱落？

以下是解释细胞脱离的一些可能原因：

• 细胞密度太高。 --> 播种更少的细胞（细胞层应在 24 小时后生长至 100% 融合，但不能过度生长）。有关伤口愈合试验的详细方案，请参阅：伤口愈合／细胞划痕实验新方法－如何划出笔直均一的划痕（这是个链接2020-12-10发布的公众号）

• 细胞正在挨饿。 --> 增加每个插入孔的培养基体积，或在细胞生长期间更换培养基。

• 在极少数情况下，细胞类型不能很好地粘附在 ibiTreat 表面。 --> 首先，覆盖盖玻片表面以促进细胞附着。然后，在插入 ibidi Culture-Insert 插件之前让涂层干燥。

以下是使用带有涂层的 ibidi Culture-Inserts 插件以促进细胞粘附的一些额外提示：

• 我们强烈建议提前测试移除ibidi Culture-Insert 插件是否会破坏迁移间隙中的涂层。这可以通过使用针对涂层蛋白的荧光标记抗体进行分析。如果迁移间隙区域中涂层的荧光信号与开放孔中的一样均匀和强烈，则可以假设在插入物移除后是保持完好的。经过几次成功的测试后进行实际实验通常是安全的。

• 如果去除插入物破坏了大部分涂层，则仅涂覆插件的孔，然后接种细胞。取出插件后，通过向培养基中添加低浓度涂层来填充间隙并孵育约 30 分钟。之后，用普通介质替换涂层溶液并继续进行迁移实验。

7的图片

8、当 Culture-Insert变干燥时，包被蛋白会失去活性吗？

这主要取决于与 Culture-Insert 插件一起使用的蛋白质类型。 使用层粘连蛋白的人通常更喜欢在涂层和细胞接种之间保持水分。 根据我们的经验，当纤连蛋白和胶原蛋白 IV 干燥时，我们没有发现对细胞迁移速度有任何影响。 

9、有没有办法用悬液细胞进行伤口愈合实验，或者该实验仅适用于贴壁细胞？

目前，使用 Culture-Insert插件的伤口愈合实验只能用于贴壁细胞。 然而，单个细胞的迁移研究可以在 µ-Slide 趋化性中通过将细胞嵌入到3D基质（例如，I 型胶原蛋白凝胶）中进行。 

10、是什么使 Culture-Inserts插件在细胞接种过程中不会泄漏？

Culture-Insert 插件由硅胶材料制成。 上部是粗料，下部是非常柔软的材料，在按下 Culture-Insert 插件后会固定在表面上。 正确插入时是不会有任何泄漏的。 

11、该如何存储 Culture-Inserts插件？

请在室温下储存 Culture-Inserts。 打开过的产品应储存在无菌容器中。 

12、有时很难在 Culture-Insert 插件中看到细胞层的汇合。 您有什么建议？

当使用相差显微镜和小孔时，例如 Culture-Insert 插件或 96 孔板，空气-水界面之间的弯月面会导致表面强烈弯曲。 这会破坏除孔中心以外的任何地方的相位对比效应。

一种解决方案是用细胞培养基完全均匀地填充 Culture-Insert 的两个孔。 通过这样做，您可以在孔上方的介质和空气之间创建一个平面。 请记住，这可能会导致两孔之间的交叉污染。

13、有时，细胞倾向于聚集在 ibidi Culture-Insert插件的边缘。 怎样才能避免这种情况？

当细胞在 Culture-Insert插件中生长到非常高的密度时，会观察到了这种情况。 为了减少细胞团块，您应该在实验开始时使用较低的细胞密度。 然而，有时细胞会粘在与细胞相容的硅胶上。 在这种情况下，我们建议较少孵育时间和/或细胞数量。 

14、Culture-Insert 如何在不造成细胞损伤的情况下模拟生理伤口？

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使用体外实验时，很难以可重复的方式模拟生理伤口。 当然，来自死细胞的碎片可能在与伤口愈合相关的迁移中发挥作用。 使用 Culture-Insert插件的 ibidi 伤口愈合实验提供了可重复的、无损伤的细胞贴片。

在体内，各种其他参数对伤口愈合的影响更大，例如不同细胞类型的相互作用。 使用 Culture-Insert插件的体外 ibidi 伤口愈合实验将迁移速度与所有这些其他影响分开，提供了一个客观且可重复的实验环境。

15、用Culture-Insert插件产生间隙时细胞是否会受损？

Culture-Insert 插件将细胞彼此分离，而不会产生传统意义上的伤口（例如，在划痕实验期间）。 目的是在不产生大量受伤细胞的情况下产生间隙，然后研究间隙闭合。该技术使用户能够将细胞的迁移行为与细胞损伤区分开来。 

16、 Culture-Inserts 插件能否用于蛋白质涂层表面？ 拔出 Culture-Insert 插件会干扰涂层吗？

一般来说，只要涂层干燥，Culture-Insert 产检可以放置在涂层表面上。 请注意，插件不会黏附在潮湿的表面上。

但是，我们强烈建议您提前测试插件移除是否会破坏迁移间隙中的涂层。 您可以使用针对涂层蛋白的荧光标记抗体来分析这一点。 如果迁移间隙区域的涂层发出的荧光信号与开放孔中的一样均匀和强烈，那么您可以假设在移除插件后涂层是保持完好的。 经过几次成功的测试后进行实际实验通常是安全的。

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　　免疫荧光实验原理

　　免疫荧光(IF)是使用显微镜深入了解细胞结构和过程的有效方法。此方法可评估特定蛋白质的表达和位置，使得免疫荧光成为科学家解决许多细胞生物学问题不可或缺的工具。

　　免疫荧光实验基于以下主要步骤：

　　1.特异性抗体与感兴趣的蛋白质结合。

　　2.荧光染料与这些免疫复合物偶联，以便使用显微镜观察感兴趣的蛋白质。

　　内皮细胞中vWF的免疫荧光染色。肌动蛋白用phalloidin染色(绿色)，细胞核用DAPI染色(蓝色)。

　　区分直接和间接免疫荧光。在直接免疫荧光中，一抗直接偶联到荧光团（也称为荧光色素），便于处理和快速可视化。在间接免疫荧光中，使用特异性结合一抗的二级荧光团偶联抗体来可视化感兴趣的结。

　　尽管di二种方法比直接免疫荧光更耗时，但它有几个显著的优势，比如它通常更便宜，因为二抗可以用于不同的一抗。此外，通过结合多个一抗和特定的二抗(每个抗体都用不同的荧光团标记)，可以在单个样品中平行特异地显示多个蛋白质(多色免疫荧光)。

　　免疫荧光染色:典型的工作流程

　　每个免疫荧光染色方案由培养、固定、染色、成像四个主要步骤组成，可细分如下:

　　免疫荧光染色是一种非常敏感的方法，可能需要排除故障《免疫英冠染色故障排除指南》。方案中的微小变化可能会导致不同的结果，而这些结果不再具有可比性。因此，在您的特定方案中精确地保持完全相同的条件是非常重要的(例如，细胞密度、抗体稀释度、培养温度和培养时间)。

　　免疫荧光实验方案对比

　　传统染色与ibidi方案染色

　　当使用任何ibidi解决方案时，ibidi的免疫荧光染色方案比传统方案要简便快速的多。无需在松散的盖玻片上生长细胞，细胞可直接在ibidi玻片上生长和染色。

　　用于免疫荧光应用的各种ibidi产品

　　更多ibidi相关产品的免疫荧光实验应用可查阅我们雷萌公众号相关文章！

　　参考文献

　　K.G. Zyner, A. Simeone, S.M. Flynn, et al. G-quadruplex DNA structures in human stem cells and differentiation. Nat Commun, 2022, 10.1038/s41467-021-27719-1

　　C. Xu, et al. NPTX2 promotes colorectal cancer growth and liver metastasis by the activation of the canonical Wnt/beta-catenin pathway via FZD6. Cell Death & Disease, 2019, 10.1038/s41419-019-1467-7

　　Kobayashi, T., et al. Principles of early human development and germ cell program from conserved model systems. Nature, 2017, 10.1038/nature22812

　　H. Tada et al. Porphyromonas gingivalis Gingipain-Dependently Enhances IL-33 Production in Human Gingival Epithelial Cells. PloS one, 2016, 10.1371/journal.pone.0152794

　　Read article

　　该应用描述了一种在流动下的粘附试验，该试验旨在研究特定细胞表面分子的作用，以确定它们在细胞附着和粘附到其他细胞类型期间的潜在相互作用。

　　对于我们的方法，我们使用预染色的鼠肿瘤细胞（多发性骨s瘤：MM）和鼠内皮细胞（EC），然后使用单克隆抗体阻断我们感兴趣的分子之一。简而言之，将EC接种到ibidi通道μ-SlidesI0.6mmLuer中，并在恒流下培养24小时。为了开始共培养，将标记的MM细胞添加到流动容器中并继续流动。24小时后，用抗体（以阻断感兴趣的分子）或相应的同种型对照处理装置，并保持流动24小时。第二天，将μ-Slides与流体单元(FU)断开并清洗以去除非粘附的MM细胞。为了分析标记的MM细胞对EC的粘附，使用共聚焦显微镜获得了μ-Slides的荧光图像。

　　1. 材料和试剂

　　•MOPC多发性骨s瘤(MM)细胞系(ATCC,TIB-23™)

　　•EOMA内皮细胞(EC)系(ATCC,CRL-2586™)

　　•含10%FCS的RPMI培养基（FisherScientific，11530586）

　　•内皮细胞生长培养基（EC培养基、CellBiologics、M1168）

　　•PBS（泛生物技术，P04-361000）

　　•非酶细胞解离溶液（Sigma-Aldrich，C5914-100ML）

　　•台盼蓝溶液（Sigma-Aldrich，93595）

　　•CellTracker™绿色CMFDA染料（ThermoFisher，C7025）

　　2. 设备和设置

　　•带有2个流体单元(FU)的ibidi泵系统，每个单元都带有用于2ml储液罐的支架（ibidi，10977）

　　•ibidiμ-SlideI0.6mmLuer，ibiTreat（ibidi，80186）

　　•ibidiPerfusionSet蓝色，15厘米，内径0.8毫米（ibidi，10961）

　　•ibidi过滤器/储液罐套装，2毫升（ibidi，10972）

　　•带细胞培养设备的层流罩

　　•培养箱（所有培养步骤均在37°C和5%CO2下进行）

　　•带有适当滤光片组和照相机的荧光显微镜

　　•粘度：0.0072(dynxs)/cm²

　　3.实验流程

　　1.准备EOMA细胞稀释液：根据制造商的说明，使用非酶细胞解离溶液分离先前培养的EOMA细胞。使用血细胞计数器（Neubauerchamber）对细胞进行计数。在EC培养基中将细胞稀释至1.2x106个细胞/ml的浓度。

　　2.种入EOMA细胞：在3个 µ-SlidesI0.6mmLuer（ibidi，80186）中加入150µlEOMA细胞稀释液（每个µ-Slide1.75x105EOMA细胞），然后孵育3小时。

表1：实验设置

　　3.启动流量：播种三小时后，将2个µ-Slides连接到流体单元FU，使用总量2.7毫升EC培养基。在8.2mbar的压力下将EOMA细胞表面的剪切应力设置为0.5dyn/cm²。测量流速并使用两个FU的平均值来计算校准因子。提前孵育FU和连接的载玻片过夜。第三个带有EOMA细胞的µ-Slide用作静态控制。在没有任何流动的情况下孵育它过夜。

　　4.准备MM细胞：根据制造商的方案，用CellTrackerGreen(CMFDA)染料在600µlRPMI培养基（不含FCS）中染色6x105MM细胞。标记后，离心细胞并使用血细胞计数器对其进行计数。

　　5.开始与MM细胞共培养：停止流动并在无菌条件下从FU水库中取出EC培养基。要开始共培养，将RPMI培养基（含10%FCS）和EC培养基以1:1的比例混合，并填充该混合物总体积为2.5ml，其中含有1.5x105MM注入两个FU储液罐。将FU重新连接到泵系统并继续流动24小时。

　　6.分子阻断：将MM细胞添加到ECs后24小时，用100µg/ml抗体（载玻片 #2）或相应的同种型对照（载玻片 #1）处理细胞，将它们直接添加到FU，无需更换介质。将孵育保持在流动状态下24小时。

　　7.清洗和成像：从FU上断开µ-Slides。用PBS清洗细胞一次，以去除任何非贴壁细胞。使用共聚焦显微镜获取荧光图像，以可视化附着在EC层上的标记MM细胞。

图1：与同种型对照处理（左图）相比，阻断特定表面分子（右图）时，MM细胞对ECs的粘附性降低

粘度是物质的一种物理化学性质，对于工业生产和科研直观重要，关于粘度有哪些小常识？

常用粘度单位换算: 

1厘泊(1cP)=1毫帕斯卡 .秒 (1mPa.s) 100厘泊(100cP)=1泊 (1P) 

1000毫帕斯卡.秒 (1000mPa.s)=1帕斯卡 .秒 (1Pa.s)

动力粘度与运动粘度的换算: η=ν. ρ 

式中η--- 试样动力粘度(mPa.s) 

ν--- 试样运动粘度(mm2/s) 

ρ--- 与测量运动粘度相同温度下试样的密度(g/cm3)

对液体而言，压强越大，温度越低，粘度越大；压强越小， 温度越高，粘度越小。  

对气体而言，压强影响不大；温度越高，粘度越大，温度越低，粘度越小。

粘度对照表

　　1.介绍

　　本应用逐步说明了如何串联连接多个Luer-Slides。优点是仅使用一个流体单元即可观察和培养多个载玻片。当使用相同规格的载玻片时，载玻片中的流速是相同的。也可以通过连接不同高度的载玻片来改变剪切速率（例如，µ-Slide I0.2Luer和µ-Slide I0.4Luer）。

　　本次介绍了两个载玻片连接的过程。但是它可以应用于大量的载玻片。

　　2.材料

　　载玻片：2片 µ-Slides I 0.6Luer, ibiTreat                ibidi (80186)

　　细胞：Endothelial cells (2.5 · 105 per slide)          e.g. Promocell

　　培养基：Endothelial Cell Growth Medium            e.g. Promocell

　　连接器：Serial Connector                                      ibidi (10830)

　　注射器：带简单Luer适配器的无菌注射器（5 ml）

　　串行连接器：

　　管道：Silicone Tubing 1.6 mm ID                           ibidi (10842)

　　适配器：Luer Connector Male                                 ibidi (10824)

　　将一个塑料连接器插入通道载玻片的两端（6厘米），以在载玻片之间连接起来。下图是在两端带有两个配套的Luer公接头的连接器管。可用乙醇或高压灭菌消毒接头。

必须在无菌条件下执行以下步骤！

　　3. 播种细胞

　　· 准备1.67 · 106 cells/ml.的细胞悬液。

　　· 将150 µl注入通道。仅填充通道体积（图1a）。

　　· 将帽盖在Luer接头上，并将载玻片放在培养箱中培养半小时来固定细胞。

　　· 细胞固定后，将两边储液接口各加60 µl充满。

　　4. 连接载玻片

　　现在准备载玻片，使细胞在通道中生长，并向储液池中填充60 µl无细胞培养基（请参见第3节）。

　　· 在连接之前，将所有储液器各加60 µl（图1b）。

　　· 将连接器管的一个Luer适配器插入载玻片的一个母Luer适配器中（图1c）。

　　· 将一些预备的培养基吸入注射器。倒转注射器并将多余的空气推出（图1d）。

　　· 使用没有气泡的注射器在载玻片端口注入。可能会有些溢出（图1e）。

　　小心地将液体注入载玻片，直到连接器管中充满为止（图1f）

　　图1：（a）接种细胞时的用量； （b）载玻片在连接之前已完全填满； （c）载玻片中插入连接管； （d）无气泡的注射器； （e）将注射器插入载玻片一端； （f）用注射器推动介质来填充连接器管道

　　· 当连接器管道完全充满时（图2a），将其插入第二张载玻片的接口上（图2b-d）。

　　· 如果要连接两个以上的载玻片，将第二个连接器管放在第二个载玻片空的另一端口上，用注射器推入介质，依此类推。

　　· 慢慢连接的所有载玻片将注射器从适配器上卸下（图2e）。

　　· 要将载玻片连接到灌注套件，两个Luer容器必须在顶部填充培养基。可用纸巾擦去过多的培养基。

　　图2：（a）连接管已完全充满； （b-c）将连接器管插入第二载玻片的鲁尔接头上； （d）带有适配接头管连接； （e）取下注射器； （f）擦去溢出的介质，并填充储液罐以连接到灌注套件。

　　5. 连接到灌注装置

　　将载玻片连接到灌注套件

　　图片串联安装带有两个µ-Slides I Luer的一个流体单元

AnielloFederico*,JochenUtikalSkinCancerUnit,GermanCancerResearchCenter(DKFZ),69120Heidelberg,Germany.*Correspondingauthor.E-mailaddress:a.federico@dkfz-heidelberg.de

为了研究肿瘤微环境影响下肿瘤细胞的运动性和侵袭特性，建立了体外2D侵袭方案。这种2D侵袭方案是一种共培养试验，在这种情况下，是由肿瘤和基质细胞（例如成纤维细胞）组成的。一旦两种细胞类型接触，在不同的条件下评估侵袭成纤维细胞单层的肿瘤细胞的数量，在我们的研究中，我们在模拟实体肿瘤微环境中发现的条件，例如与基质细胞（成纤维细胞）的相互作用以及成纤维细胞释放的可溶性因子（Nnetu等，2012）。我们使用A375黑色素瘤细胞系和真pi成纤维细胞进行了此测定。黑色素瘤细胞激活成纤维细胞，继而维持肿瘤细胞的生长，恶性转化和耐药性（Flach等，2011）。然而，在刺激所测试的抗ai化合物后，我们发现与成纤维细胞直接接触的黑素瘤细胞显示出运动能力受损并且未能侵袭成纤维细胞层。

材料和试剂

1. GFP-A375细胞系（ATCC）

2. 番茄皮成纤维细胞（从健康患者中分离）

3. MEF细胞培养基

4.PBS（Sigma-Aldrich；D8537）

5.胰蛋白酶-EDTA溶液（Sigma-Aldrich；T3924）

6. 台盼蓝溶液（Sigma-Aldrich;93595）

7.DMSO（CarlRoth;A994.2），在0.1％最终浓度下使用

8.MithramycinA（BioTrend；10-2085-5mg），在300nm浓度下使用，用DMSO稀释

仪器设备

1. 层流净化罩

2. 12/24孔多孔板（GreinerBio-One）

3. 台式离心机

4. 细胞计数器

5. 2孔插件（ibidi: 80209）/预置2孔插件培养皿（ibidi:81176）

6.细胞培养管

7. 涡旋

8. 镊子

9. 光学显微镜

10. 荧光显微镜

11. NIS-Elements软件

ibidi:81176

实验流程

01. 将GFP-A375和番茄成纤维细胞系稳定地保存在MEF培养基中，在37°C和5%C02加湿培养箱中。

02. 当细胞达到亚融合度（约80％融合度）时，在带有PBS的通风橱中清洗它们，以去除死细胞和碎片。

03. 在培养箱中用胰蛋白酶-EDTA溶液胰蛋白酶消化细胞约5分钟，然后添加MEF培养基以阻止反应。

04. 将细胞悬浮液收集在15ml细胞培养管中，并用台式离心机（1500xg,5´,RT）短暂离心。

05. 将细胞重新悬浮在新鲜培养基中；将一体积的细胞悬液与另一体积的台盼蓝溶液混合，用细胞计数器计数活细胞。

06. 在MEF缓冲液中以4x105细胞/ml的浓度稀释细胞。

07. 在多孔板上，在每个孔的中间放置一个Culture-Insert2孔（2孔培养插件）。

08. 用75µl（3x104细胞）FP-A375细胞填充插入物一侧，并用番茄成纤维细胞填充另一侧。用移液器上下混合插入物中的细胞，以确保细胞完全分布。

09. 将多孔板放在培养箱中，放置过夜。

10. 第二天，在镊子的帮助下，小心地从每孔中取出培养基和插件，并用PBS清洗。

11. 小心除去PBS，然后加入新鲜的MEF培养基。

12. 用光学显微镜检查GPF-A375与Tomto成纤维细胞之间产生的间隙的闭合状态。

13. 一旦每个孔中的间隙完全闭合，请使用荧光显微镜和成像软件获取荧光图像。确保肿瘤细胞尚未侵入成纤维细胞单层。

14. 小心地除去培养基，并在控制组孔中添加培养基+0.1％PBS，在处理组孔中添加培养基+300nM丝裂霉素A。将板放在培养箱中24小时（处理孵育时间）。

24小时后，在荧光显微镜下重新采集共培养孔，以评估治疗组与对照组（绿色荧光细胞散布在红色标记层上）的肿瘤细胞侵袭行为的任何变化（图2）。

图1：2D侵袭系统的示意图

图2：2D侵袭检测的荧光图像

将黑素瘤细胞和成纤维细胞共培养，然后暴露于300nmMithramycinA（或DMSO）。24小时后，评估侵袭成纤维细胞层的肿瘤细胞的数目。A375细胞显示出大规模的侵袭行为，受到MithramycinA治疗的损害。比例尺：500μm。

备注：

1.此处描述了MEF培养基组成（参考文献1）。

2.此文仅供参考。

3.此实验方案来自ibidi的实际用户，更多详情可联系本文作者。

参考文献：

1.MithramycinAandmithralogEC-8042inhibitSETDB1expressionanditsoncogenicactivityinmalignantmelanoma. FedericoA,SteinfassT,LarribèreL,NovakD,MorísF,NúñezLE,UmanskyV,UtikalJ.MolelucarTherapy-Oncolytics2020;doi: https://doi.org/10.1016/j.omto.2020.06.001 (Methoddescribedinthisprotocolwasincludedinthispublishedarticle).

2.Theimpactofjammingonboundariesofcollectivelymovingweak-interactingcells. NnetuKD,KnorrM,KäsJ,ZinkM.NewJournalofPhysics2012;doi:https://doi.org/10.1088%2F1367-2630%2F14%2F11%2F115012

3.Fibroblastscontributetomelanomatumorgrowthanddrugresistance. FlachEH,RebeccaVW,HerlynM,SmalleyKS,AndersonAR.Molecular pharmaceutics2011;doi:10.1021/mp200421k

通过血管网络，肿瘤可以源源不断地获取营养物质和氧气，并进行增殖和转移。贝伐珠单抗（Bev）作为一种GX的抗血管生成抗体，一方面能够阻断血管内皮生长因子（VEGF）并YZ肿瘤血管生成，另一方面能够使血流正常化，降低组织间质液压力，从而使ZL药物可以进入肿瘤深处并均匀分布。

如何利用Bev的优势对肿瘤进行有效治 疗呢？

中 国药科大学工学院黄德春教授和陈维教授团队在ACS期刊《Biomacromolecules》上发表了题为“Tumor-Adhesive and pH-Degradable Microgels by Microfluidics and Photo-Cross-Linking for Efficient Antiangiogenesis and Enhanced Cancer Chemotherapy”的文章并给出了解决方案。

该文章报道了经多巴胺（DA）修饰的聚乙烯醇（PVA）微凝胶，这种微凝胶还“装载”有Bev和多西紫杉醇（DTX），表示为——DMGs@Bev/DTX。DMGs@Bev/DTX对肿瘤的作用机理如下：

1） 对肿瘤组织具有粘附性的DA使得DMGs@Bev/DTX可以长时间保留在肿瘤部位；

2） 对pH有响应的PVA在肿瘤区域酸性条件下可以发生降解，并持续释放出Bev和DTX；

3） Bev可以YZ肿瘤血管生成，进而遏制肿瘤的增殖和转移；

4） DTX可以对肿瘤进行化疗，起到消灭肿瘤的效果。

其中，DMGs@Bev/DTX对于荧光素酶（Luc）基因标记的4T1肿瘤模型小鼠的治LX果通过光学成像进行了研究——Figure 4. C图右下DMGs@Bev/DTX实验组，经过10天的ZL后，肿瘤已基本消除——Luc生物发光实验在VILBER多功能活体成像系统——Fusion FX7上完成。

VILBER Fusion FX7多功能成像系统

产品特点：

· 采用新一代深度制冷的CCD相机，暗电流0.0001e/p/s@-90℃, 制冷速度更快且寿命更长；

· F0.7超级镜头，大大提高了单位时间内的进光量，从而有效缩短曝光时间，尤其适用于Luc报告基因检测的生物发光成像；

· 荧光成像采用脉冲LED光源，7通道，激发强度比卤素灯更高。基于扫描方式，激发均一性≥99%；

· 全自动控制7位发射滤光片轮，搭载6个专用窄波滤光片，涵盖400~900nm，满足多种染料的检测需求；

· 配备小鼠专用恒温台兼容小鼠麻醉系统，通量可达5只小鼠。

应用范围：

· 小动物成像：基于生物发光或荧光的肿瘤发育、药物代谢、细胞迁移追踪、纳米材料研究等；

· 植物成像：LUC 或GFP、RFP等报告基因检测，转基因鉴定、基因互作、微生物侵染、植物发育、植物生物节律等；

· 化学发光 & 荧光Western blot，Northern blot或Southern blot；

· 免染胶，银染&考染蛋白胶，SSCP胶，培养皿（细胞或菌落），微孔板，蛋白芯片或其他基于荧光或化学发光的样品。

　　肿瘤血管化

　　没有营养和氧气，肿瘤细胞就无法生存。因此，超过有限大小的癌症生长需要伴随血管化，这是由多种分子机制诱导的。

　　在癌症进展的早期，当癌细胞变得缺氧时，血管生成过程就会被激活，因为它们与血液循环系统无关。作为对缺氧的反应，肿瘤细胞和周围的基质细胞开始分泌促血管生成生长因子，如 VEGF，其通过多种机制诱导血管形成。

　　这种“血管生成开关”允许肿瘤不受初始限制地生长和增殖。除了氧气和营养物质的输送外，新形成的血管还通过促进癌细胞向远处的传播来提供废物运输和促进转移。因此，在抗血管生成疗法的研究中投入了大量精力也就不足为奇了，其中许多已被批准用于几种类型的癌症。

　　然而，由于肿瘤血管化是癌症进展和肿瘤维持过程中的重要过程，也可以作为治疗靶点，因此血管生成测定是癌症研究中广泛使用的工具。

　　Lugano, R., Ramachandran, M., & Dimberg, A. (2020). Tumor angiogenesis: causes, consequences, challenges and opportunities. Cellular and Molecular Life Sciences. 10.1007/S00018-019-03351-7

　　血管生成实验解决方案

　　µ-Slide 血管生成和µ-Slide 血管生成玻璃底部可确保在任何倒置显微镜上方便地观察管形成，没有凝胶半月板形成，节省基质胶。

　　µ-Slide 血管生成和µ-Slide 血管生成玻璃底部可确保在任何倒置显微镜上方便地观察管形成，没有凝胶半月板形成，节省基质胶。

　　所有常见的 3D 凝胶基质，例如 ibidi Collagen Type I、Rat Tail、Matrigel ®和类似的水凝胶，都可以在 ibidi 血管生成检测中使用。此外，载玻片的设计将所需的凝胶量降至 10 µl，从而大大降低了成本。

　　对于大规模血管生成实验，我们提供了µ-Plate 血管生成 96 孔

　　iTube Formation FastTrack AI 图像分析是一种基于 AI 的自动图像分析解决方案，用于血管形成分析，可在几分钟内提供客观且可重复的结果。

　　参考文献：

　　Tube formation assay to analyze angiogenesis in triple-negative breast cancer using the µ-Plate Angiogenesis 96 Well Wang, Y., Wu, S., Zhu, X., Zhang, L., Deng, J., Li, F., Guo, B., Zhang, S., Wu, R., Zhang, Z., Wang, K., Lu, J., & Zhou, Y. (2020). LncRNA-encoded polypeptide ASRPS inhibits triple-negative breast cancer angiogenesis. Journal of Experimental Medicine. 10.1084/JEM.20190950/132618

　　Tube formation assay to test for angiogenesis in ovarian cancer in the µ-Plate Angiogenesis 96 Well Noh, K., Bach, D. H., Choi, H. J., Kim, M. S., Wu, S. Y., Pradeep, S., Ivan, C., Cho, M. S., Bayraktar, E., Rodriguez-Aguayo, C., Dasari, S. K., Stur, E., Mangala, L. S., Lopez-Berestein, G., & Sood, A. K. (2020). The hidden role of paxillin: localization to nucleus promotes tumor angiogenesis. Oncogene. 10.1038/s41388-020-01517-3

　　Tube formation assay to analyze angiogenesis in lung cancer using the µ-Slide Angiogenesis Xu, Z., Guo, C., Ye, Q., Shi, Y., Sun, Y., Zhang, J., Huang, J., Huang, Y., Zeng, C., Zhang, X., Ke, Y., & Cheng, H. (2021). Endothelial deletion of SHP2 suppresses tumor angiogenesis and promotes vascular normalization. Nature Communications. 10.1038/s41467-021-26697-8

　　细胞划痕实验（Wound Healing)是一种操作简单，经济实惠的研究细胞迁移/肿瘤侵袭的体外试验方法。为了研究细胞迁移的机制，科学家们传统上转向“划痕试验”，它利用移液器尖端在多孔板中的单层细胞上“划痕”，并观察间隙所需闭合的时间（这些有时也被称为“伤口闭合”或“伤口愈合”分析）。这种类型的实验允许分析细胞迁移，并可以用各种药物和化学品来增强，以阐明特定的机制。

　　在 ibidi 35mm µ-Dish 中培养的内皮细胞，预置2-Well Culture-Insert。移除插件后，让细胞迁移 24 小时，然后固定在 4% PFA 中，并进行透化。VE-钙粘蛋白（洋红色）、 F-肌动蛋白用鬼笔环肽（绿色）和细胞核用DAPI（蓝色）的抗体染色，然后进行共聚焦成像。

　　Derek Sung, University of Pennsylvania School of Medicine：

　　我一直都有进行划痕分析。与大多数体外测定类似，一致性是获得准确和可重复结果的关键。作为进行过无数次此实验的人，使用移液器手动创建间隙存在一些过去给我带来麻烦的关键问题。这就是为什么发现 ibidi Culture-Inserts是一种救星。ibidi 细胞培养插件与传统的划痕检测方法相比具有许多优势：

　　1. 标准的间隙距离

　　传统划痕分析和使用移液管手动划痕大挑战之一是间隙距离不一致。而且，划痕往往划不直。因此，起始距离通常会在几十到几百微米之间变化。ibidi 的细胞培养插件中心会产生500 µm 无细胞的人造间隙。这确保了间隙是直的，并且每次的距离都是一致的。

　　2. 干净的迁移边缘

　　手动划痕还会产生未完全去除的自由浮动细胞的问题。这些自由漂浮的细胞可以通过延迟自由边缘的迁移、释放细胞内内容物或重新附着来影响迁移率。ibidi 的细胞培养插件是可移除的，留下干净笔直的边缘。

　　3. Z小化细胞数

　　传统的划痕检测是在多孔板中完成的，需要一层汇合的细胞。如果实验有多种条件（药物治疗或基因操作）并且需要多次重复，这会需要增加大量细胞。对于珍贵或昂贵的细胞（例如从难以获得的组织中分离出的原代细胞），这些实验可能变得难以进行。ibidi 的细胞培养插件具有较小的生长面积，可大限度地减少实验所需的细胞数量（准确地说，每孔0.22 cm 2）。这允许大限度地利用宝贵的细胞或增加重复次数。

　　4. 盖玻片底皿

　　划痕分析通常在多孔板中进行，底部厚，聚苯乙烯，只允许明场成像和间隙距离的量化。ibidi 的细胞培养插件具有经过组织培养处理和灭菌的盖玻片底部。这允许进行明场和免疫荧光成像。就我个人而言，我认为这是该产品好的方面，让我们能够看到如细胞骨架、细胞粘附形态、核形态等结构。此外，多模态成像功能大限度地提高了单个实验的数据量，从而节省了成本和试剂。

　　5. 单个实验的独立插件

　　“边缘效应”是指一种细胞培养现象，其中多孔板外周的孔比内孔经历更多的蒸发，导致不同的条件和潜在的不一致结果。使用多孔板进行划痕检测时可以看到类似的效果，影响结果的一致性和重现性。ibidi 的细胞培养插件单独包装，用于单次实验。这可以防止任何“边缘效应”并确保数据一致。另外，培养皿设计有盖子锁定功能，以确保在处理盘子时盖子保持打开状态。

　　与枪头划痕检测相比，ibidi 伤口愈合插件可提供更高的重现性

　　由于细胞迁移开放区域随时间发生变化。使用 ibidi Culture-Insert 2 孔（左）和用移液器吸头刮擦产生间隙的对比。数据来源：德国弗莱堡大学的 M. Börries。

　　乍一看，枪刮和放置插件的方法似乎是两种非常相似的创建无细胞间隙的方法。 然而，仔细观察，这两种方法可能在重要检测结果方面的影响有所不同：

　　小鼠 L929 成纤维细胞的多细胞球体是在µ-Slide 球体灌注中创建的。在从细胞悬浮液中形成球体后，使用 ibidi 泵系统进行灌注。添加 ibidi Pump 可确保球体在长期培养过程中获得最佳营养。

　　在灌注培养 1 周后，将球体固定并用鬼笔环肽染色以观察 F-肌动蛋白细胞骨架。最后，球体被清除以增强成像深度和分辨率。我们使用EMOVI 方法进行具有成本效益、无害的整体成像，这可以在固定球体上实现基于抗体的多重免疫标记。球体的清除允许分析整个球体成纤维细胞甚至在球体成纤维细胞中心的成纤维细胞的分布和组织，同时保留球体的形态

　　01材料和试剂

　　细胞和试剂

　　•L929成纤维细胞（DSMZ，编号ACC 2）

　　•Accutase(A1110501,Gibco)

　　•细胞培养基 RPMI-1640 (Gibco, 21875034)

　　•胎牛血清 (FCS, Gibco, 10270106)

　　•细胞内 (IC) 固定缓冲液 (eBioscience, 00-8222-49)

　　•Dulbecco 磷酸盐缓冲液（PBS、Sigma、D8537）

　　•正常小鼠血清（Jackson，015-000-120）

　　•正常驴血清（Jackson，AB_2337258）

　　•Triton X-100（Alfa Aesar，A16046）

　　•Flash Phalloidin™ Green 488（鬼笔环肽；500x，Thermo Fisher Scientific，46410）

　　•4'，6-二脒-2-苯基吲哚（DAPI，浓度20μg/mL，西格玛奥德里奇，D9542）

　　•去离子水 (diH2O)

　　•异丙醇（Carl Roth，CP41.2）

　　•肉桂酸乙酯 (ECi) (Sigma, W243000)

　　02缓冲液和溶液

　　培养基

　　•新鲜制备并在 4°C下储存长达一周

　　•基础培养基 RPMI-1640 (Gibco, 21875034)

　　•10%  FCS （ Gibco，10270106）

　　封闭和染色缓冲液

　　•PBS 

　　•1% （v/v）FCS 

　　•1% (v/v) 正常小鼠血清

　　•1% (v/v) 正常山羊血清

　　•0.3% (v/v) Triton  X-100

　　染色液

　　•封闭和染色缓冲液

　　•1:500 鬼笔环肽（最终浓度 1x）

　　•1:10 DAPI（最终浓度 2 µg/mL）

　　30% / 50% / 70% (v/v) 异丙醇稀释液

　　•混合适当体积的 diH2O 和异丙醇

　　•使用前预冷至 4 °C

　　03 设备   

　　•ibidi 泵系统 (ibidi, 10902)

　　•具有生物惰性表面钝化的 ibidi µ-Slide 球体灌注（ibidi，80350）

　　•用于 µ-Slide 的 ibidi 串行连接器（ibidi，10830）

　　•ibidi 灌注套装蓝色 (ibidi, 10961)

　　•层流罩

　　•培养箱，37°C 和 5% CO2

　　•血细胞计数器（康宁)

　　•移液器(康宁）

　　•倒置共聚焦显微镜（Leica TCS SP8）

　　•徕卡应用套件 X

　　•LIGHTNING（反卷积软件）

　　•Imaris v9.5

　　04 操作程序

　　第一部分：µ-Slide球体灌注中的球体形成和培养

　　请在使用 µ-Slide Spheroid Perfusion 之前阅读指示。所有步骤均需在无菌条件下执行。

　　开始实验之前，在标准细胞培养瓶（例如 T75）中制备 L929 成纤维细胞，细胞粘附在底部。细胞在实验当天应该是健康的并且最佳亚汇合。

　　重要提示：在 37°C 和 5% CO2的培养箱内过夜平衡所有必需的材料，例如载玻片、培养基和管道（灌注套件）。平衡对于防止气泡随着时间的推移而出现至关重要。

　　1. 将60 µl 无细胞培养基注入 µ-Slide Spheroid Perfusion 的每个通道（根据说明用提供的盖玻片封闭）

　　2. 在培养箱中 37°C 孵育 2 小时。孵育期间始终关闭盖子。

　　3. 用 Accutase 处理培养的 L929 细胞 1-2 分钟以使其脱离。

　　4. 收集细胞悬液，离心，在培养基中稀释；量取决于所需的细胞浓度。

　　5. 对细胞计数并调整至终浓度为 5 x 105cells/ml。

　　6. 用无细胞培养基冲洗 µ-Slide 球体灌注的通道，以去除潜在的气泡。

　　7. 将 45 µl 细胞悬液直接移入每个通道。

　　8. 在 37°C 下孵育 1 小时，使细胞在壁孔中沉淀。

　　9. 用60 µl 无细胞培养基填充 µ-Slide Spheroid Perfusion 的储液库。

　　10. 在 37°C 下孵育过夜以形成球体。

　　11. 检查通道是否有气泡。如果通道中存在任何气泡，请用无细胞培养基小心冲洗通道。

　　12. 使用ibidi 串行连接器连接 µ-Slide Spheroid Perfusion 的 3 个通道

　　13. 根据ibidi 泵系统、流体单元和灌注装置指示.

　　14. 将µ-Slide 球体灌注连接到 ibidi 泵系统并开始流动。使用尽可能低的流速（5 mBar 气压导致流速为 0.74 ml/min）。进行实验，直到球体具有所需的成熟状态，在这种条件下培养 7 天后。

　　图1：L929 成纤维细胞在孔中形成球体并在流动条件下培养

　　图 2：L929 成纤维细胞在µ-Slide 球体灌注中显示球体形成。第1 天的示例

　　(A)第 6 天 (B)，使用 ibidi 泵系统灌注，0.74 毫升/分钟。相差显微镜，10 倍物镜，井径 800 µm。

　　第二部分：L929 球体的染色和清除

　　染色直接在 µ-Slide Spheroid Perfusion 中进行。在开始染色之前，请阅读指示并遵循载玻片中关于一般移液和更换溶液的建议。

　　1. 当 L929 球体培养达到所需的成熟状态（此处为 7 天后）时，小心地断开 µ-Slide球体灌注与 ibidi 泵系统的连接。

　　2. 在 RT 处用冷 IC 固定缓冲液固定球体 10 分钟。

　　3. 在 RT 中将球体封闭和染色缓冲液中孵育 1 小时。

　　4. 在 37°C 下用染色溶液孵育球体过夜。从这一点开始，保持载玻片避光。图 3A 显示了清除前的球体成像。

　　5. 第二天，用 Blocking and Staining Buffer 清洗细胞一次。

　　6. 通过在冰上以上升 30%、50% 和 70% 的异丙醇稀释液孵育15 分钟，依次使球体脱水。

　　7.  在冰上用纯异丙醇孵育球体两次 15 分钟。

　　8.  从冰中取出载玻片，让它升温至 RT。

　　9.  执行清除：在 RT 处用纯 ECi 灌注两次。在这个阶段，球体可以避光储存数周，而不会显着损失荧光。

　　10.  使用共聚焦显微镜的图像球体（参见图 3）。

　　图 3：清除前后染色 L929 球体的共聚焦显微镜（红色：鬼笔环肽，青色：DAPI）。

　　(A) 清除前的球体。请注意，由于光散射和吸收，只能看到外围细胞，而看不到中心的细胞。(B, C) 清除后的球体。请注意，清洗前后的尺寸差异源于脱水和清洗过程，同一位置的横截面。(B) 横截面 (C) 体积/3D 视图。球体的清除允许即使在球体成纤维细胞的中心也可以看到细胞，同时保留球体的形态。细胞核的计数甚至可以确定形成该球体的细胞数。

　　点击请查看清除前后染色球体的直接对比视频 (z-stack of 440 slices at a slice spacing of 0.36 µm)。

　　注：此实验方案来自ibidi的实际用户，更多详情可联系本文作者E-mail address: selina.keppler@tum.de

　　仅供科研使用！