给点有关光纤通信的科普知识

　　1、哪种细胞密度最适合我的实验？

　　通常，我们建议每孔使用5,000-10,000个HUVEC。 但是，确定最佳细胞数对于使用µ-Slide血管生成从管形成测定中获得最佳结果是至关重要。 细胞密度取决于细胞类型和细胞大小。 因此，在开始实际实验之前，我们建议在非抑制条件下播种几个细胞数并对管形成进行成像。 然后，对于最佳测定条件，使用在您的实验中产生最多管数的细胞密度。请记住，细胞通常不会在凝胶基质上增殖。请参阅：血管生成实验实验装置优化和数据分析 |ibidi µ-Slide

　　2、应该在哪个时间段内观察细胞？

　　管形成的持续时间取决于细胞类型和所使用的细胞外基质，应单独确定。 通常，HUVEC在 2-4小时后已经形成管。24小时后细胞开始发生凋亡，这导致从基质中脱离和管破裂。请参阅：血管生成实验实验装置优化和数据分析 |ibidi µ-Slide

　　3、是否需要活细胞成像装置来每小时拍摄管形成测定的照片？

　　非必须，通过显微镜对 µ-Slide 血管生成上的同一位置进行一致和精确的成像。 可以使用显示 x/y 坐标的显微镜载物台或自动载物台来完成成像。 使用自动化平台，可以将孔的所有位置（特别是每个孔的中心）保存到位置列表中，您可以在每个时间点访问相应的位置。

　　但是，使用完整的活细胞成像设置在显微镜上建立生理条件要方便得多。使用ibidi Stage Top 孵育系统等活细胞孵育装置有助于在成像过程中提供稳定温度和湿度条件，从而在体外可以直接进行视频拍摄。

　　4、是否可以使用 µ-Slide 血管生成在凝胶基质内培养细胞？

　　可以，µ-Slide 血管生成非常适合在精确定义的3D基质中培养细胞。由于大界面的凝胶和顶部细胞培养基，凝胶中的条件可以通过更换上部储液器中的介质来调整。

　　5、应该在管形成实验中使用含酚红的凝胶还是不含酚红的凝胶？

　　对于使用µ-Slide血管生成的管形成测定中的相差显微镜，酚红不会干扰图片，并且由于其颜色，处理更容易。然而，当使用荧光显微镜时，酚红可能会干扰探头的波长。在这种情况下，应该使用无酚红凝胶。

　　6、是否需要将µ-Slide Angiogenesis血管生成载玻片放入培养箱的湿室中进行凝胶聚合？

　　我们建议将µ-Slide血管生成载玻片放入加湿腔中进行凝胶聚合。 虽然反应室对于聚合本身不是必需的，但它可以最大限度地减少蒸发的影响。 在高流量孵化器中，防止蒸发的足够百分比的湿度可能不会始终保持一致。 µ-Slide血管生成中的少量凝胶会很快变干，这会导致弯液面的形成。

　　7、胎牛血清 (FBS) / 胎牛血清 (FCS) 浓度是否会影响管形成实验中的管形成和降解速率？

　　一般是的。 这取决于所使用的细胞类型或细胞系。 当提供浓度高达 10% FCS 的细胞培养基时，我们在 µ-Slide 血管生成中观察到典型的原代细胞 (HUVEC) 管形成和 Matrigel® 上的几种内皮细胞系。 但是，我们建议分别优化每个细胞系的 FBS/FCS 浓度。

　　8、您是否推荐使用减少生长因子的 Matrigel® 进行管形成分析？

　　对于使用µ-Slide血管生成的管形成测定，我们使用了减少生长因子的 Matrigel® 和未减少的 Matrigel®。请参阅：肿瘤学必备 | 血管生成实验介绍

　　9、我们希望使用减少了生长因子的 Matrigel® 和无血清培养基以及 50 ng/ml VEGF。 这足以刺激管的形成吗？

　　可以，这种组合足以刺激ibidi血管生成实验室器皿中的管形成，而培养基中没有任何额外的生长因子。

　　10、除了 Matrigel® 之外，您在试管形成实验中是否有使用其他凝胶的经验？

　　原则上，任何凝胶都可用于µ-Slide血管生成管形成实验。 细胞可以附着在表面上是很重要的。 胶原蛋白、纤连蛋白和层粘连蛋白为细胞粘附提供了重要的结合基序。

　　11、什么是管形成实验合适的阳性和阴性对照？

　　建议使用阳性和阴性对照来减少管形成实验中的变量。阳性对照是预期细胞在其中形成血管的样本（取决于实验设置），从而向研究人员表明该实验已正确进行。阴性对照是与所有其他样品以相同方式处理的样品，但预计不会显示任何实验结果（例如，很少或没有管形成）。

　　ibidi血管生成实验室器皿中管形成实验的最佳阳性和阴性对照很大程度上取决于所使用的细胞、凝胶基质和一般实验设置。因此，我们建议您查阅文献，了解您感兴趣的主题中成功使用的对照（阳性和阴性对照）。

　　在下文中，您可以找到管形成测定中阳性和阴性对照的可能方法：

　　如果需要分析特定化合物诱导血管生成的效力，则可以使用用已知血管生成诱导剂（例如 VEGF 或 FGF2）处理的样品作为阳性对照。浓度很大程度上取决于细胞类型和实验设置。

　　如果使用原代细胞，预筛选的内皮细胞系（例如，HUVEC）在用特定生长因子处理后表现出明确的反应，可以作为阳性对照。

　　对于某些细胞类型，形成管的能力还取决于所使用的凝胶基质。作为阳性对照，内皮细胞应在含有饥饿培养基（不含生长因子或血清的培养基）的生长因子减少的 Matrigel®上显示管形成。如果需要测试促血管生成物质，则使用饥饿培养基尤其重要，因为大多数细胞培养基都添加了生长因子。为了分析物质的真实效果，基质和培养基都必须不含任何生长因子。作为阴性对照，细胞可以播种在不同的基质（例如胶原蛋白 I）上，预计不会形成管状。

　　不影响细胞活力的管形成抑制剂（例如，苏拉明或萝卜硫素）可用作阴性对照。如果实验的目的是测试抗血管生成物质，则使用这种类型的抑制剂尤其重要。

　　如果用任何溶解的物质（例如，在 DMSO 或乙醇中）处理细胞，则仅使用溶剂作为阴性对照。

　　12、是否有用于分析管形成实验的推荐染色方案？

　　一般来说，相差显微镜足以自动分析 µ-Slide血管生成中的标准管形成实验。 但是，如果您想研究某种标记，您可以应用您的标准方案（例如，用于免疫荧光染色），但要小心，以免损坏凝胶基质或细胞网络。

　　使用calcein的染色方案示例可参阅：肿瘤学必备 | 血管生成实验介绍

　　13、在开始实验之前，我是否必须将 ibidi 血管生成实验室器皿平衡到 37°C？

　　不，不需要平衡 µ-Slide 血管生成。 在室温下储存，可以立即用凝胶基质填充。 由于µ-Slide 的开孔形式，加热时从凝胶中逸出的气体可以与大气自由交换。

　　14、完成实验后，µ-Slide Angiogenesis和µ-Plate Angiogenesis 96 Well可以重复使用吗？

　　不可以，µ-Slide血管生成载玻片和µ-Plate血管生成96孔板是一次性耗材，仅供一次性使用。

　　15、µ-Slide 血管生成是否有96孔版的？

　　有。 µ-Plate血管生成96孔板具有与µ-Slide血管生成相同的“孔中孔”设计和凝胶体积 (10 µl)。 µ-Plate血管生成96孔可用作高通量管形成实验的筛选板，具有完全的ANSI/SLAS (SBS) 和robotics兼容性。

1、Culture-Inserts插件可以重复使用吗？

尽管 Culture-Inserts 插件中的材料可高压灭菌并且与酒精相容，但我们不建议重复使用。 如果您仍想尝试重复使用，则需要建立一个用酸或碱的清洁程序。 ibidi没有任何清洁Culture-Inserts插件的经验，虽然它们可能会保持粘性，但之前实验的残留可能会影响重现性。 

2、可否在盖玻片上使用 Culture-Inserts插件吗？

可以，您可以在任何盖玻片上使用 Culture-Inserts插件。 到目前为止，还没被报告与任何干燥表面不相容。 

3、是否可以使用 Culture-Insert 插件制作小于 500 µm 的伤口？

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不可以，Culture-Inserts 插件中最小和标准的伤口尺寸是 500 µm。 Culture-Insert 4 Well /4孔插件会有一个额外的中心间隙，伤口大小为 1000 µm。

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4、Culture-Insert 插件是如何固定在培养皿上的？

Culture-Insert 插件由生物相容的硅胶材料制成。 硅胶底部有一个粘性表面，可粘附（粘）在任何平坦、干燥、均匀的表面。 这种材料足够柔软可粘到表面上。 您可以用无菌镊子按压插件来简单地修复它。

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 5、您是否曾经遇到过 Culture-Inserts 插件无法粘附在定制涂层表面上的问题？

只要表面干燥，我们从未遇到过让 Culture-Inserts 插件粘附在定制涂层表面上的任何问题。 但是，潮湿的表面会导致泄漏。 因此，请确保您的定制涂层表面完全干燥。

6、需要在 Culture-Insert 插件中播种多少个细胞才能进行细胞迁移实验？

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开始迁移实验时，Culture-Insert 插件中的细胞层应融合。 在所有实验中，汇合细胞层的密度应尽可能一致。 使用的接种细胞数量取决于您的细胞类型，因此您可以在 Culture-Insert 2 Well 说明书中找到推荐的范围和详细方案。 

7、为什么移除 ibidi Culture-Insert 插件后细胞有时会从盖玻片上脱落？

以下是解释细胞脱离的一些可能原因：

• 细胞密度太高。 --> 播种更少的细胞（细胞层应在 24 小时后生长至 100% 融合，但不能过度生长）。有关伤口愈合试验的详细方案，请参阅：伤口愈合／细胞划痕实验新方法－如何划出笔直均一的划痕（这是个链接2020-12-10发布的公众号）

• 细胞正在挨饿。 --> 增加每个插入孔的培养基体积，或在细胞生长期间更换培养基。

• 在极少数情况下，细胞类型不能很好地粘附在 ibiTreat 表面。 --> 首先，覆盖盖玻片表面以促进细胞附着。然后，在插入 ibidi Culture-Insert 插件之前让涂层干燥。

以下是使用带有涂层的 ibidi Culture-Inserts 插件以促进细胞粘附的一些额外提示：

• 我们强烈建议提前测试移除ibidi Culture-Insert 插件是否会破坏迁移间隙中的涂层。这可以通过使用针对涂层蛋白的荧光标记抗体进行分析。如果迁移间隙区域中涂层的荧光信号与开放孔中的一样均匀和强烈，则可以假设在插入物移除后是保持完好的。经过几次成功的测试后进行实际实验通常是安全的。

• 如果去除插入物破坏了大部分涂层，则仅涂覆插件的孔，然后接种细胞。取出插件后，通过向培养基中添加低浓度涂层来填充间隙并孵育约 30 分钟。之后，用普通介质替换涂层溶液并继续进行迁移实验。

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8、当 Culture-Insert变干燥时，包被蛋白会失去活性吗？

这主要取决于与 Culture-Insert 插件一起使用的蛋白质类型。 使用层粘连蛋白的人通常更喜欢在涂层和细胞接种之间保持水分。 根据我们的经验，当纤连蛋白和胶原蛋白 IV 干燥时，我们没有发现对细胞迁移速度有任何影响。 

9、有没有办法用悬液细胞进行伤口愈合实验，或者该实验仅适用于贴壁细胞？

目前，使用 Culture-Insert插件的伤口愈合实验只能用于贴壁细胞。 然而，单个细胞的迁移研究可以在 µ-Slide 趋化性中通过将细胞嵌入到3D基质（例如，I 型胶原蛋白凝胶）中进行。 

10、是什么使 Culture-Inserts插件在细胞接种过程中不会泄漏？

Culture-Insert 插件由硅胶材料制成。 上部是粗料，下部是非常柔软的材料，在按下 Culture-Insert 插件后会固定在表面上。 正确插入时是不会有任何泄漏的。 

11、该如何存储 Culture-Inserts插件？

请在室温下储存 Culture-Inserts。 打开过的产品应储存在无菌容器中。 

12、有时很难在 Culture-Insert 插件中看到细胞层的汇合。 您有什么建议？

当使用相差显微镜和小孔时，例如 Culture-Insert 插件或 96 孔板，空气-水界面之间的弯月面会导致表面强烈弯曲。 这会破坏除孔中心以外的任何地方的相位对比效应。

一种解决方案是用细胞培养基完全均匀地填充 Culture-Insert 的两个孔。 通过这样做，您可以在孔上方的介质和空气之间创建一个平面。 请记住，这可能会导致两孔之间的交叉污染。

13、有时，细胞倾向于聚集在 ibidi Culture-Insert插件的边缘。 怎样才能避免这种情况？

当细胞在 Culture-Insert插件中生长到非常高的密度时，会观察到了这种情况。 为了减少细胞团块，您应该在实验开始时使用较低的细胞密度。 然而，有时细胞会粘在与细胞相容的硅胶上。 在这种情况下，我们建议较少孵育时间和/或细胞数量。 

14、Culture-Insert 如何在不造成细胞损伤的情况下模拟生理伤口？

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使用体外实验时，很难以可重复的方式模拟生理伤口。 当然，来自死细胞的碎片可能在与伤口愈合相关的迁移中发挥作用。 使用 Culture-Insert插件的 ibidi 伤口愈合实验提供了可重复的、无损伤的细胞贴片。

在体内，各种其他参数对伤口愈合的影响更大，例如不同细胞类型的相互作用。 使用 Culture-Insert插件的体外 ibidi 伤口愈合实验将迁移速度与所有这些其他影响分开，提供了一个客观且可重复的实验环境。

15、用Culture-Insert插件产生间隙时细胞是否会受损？

Culture-Insert 插件将细胞彼此分离，而不会产生传统意义上的伤口（例如，在划痕实验期间）。 目的是在不产生大量受伤细胞的情况下产生间隙，然后研究间隙闭合。该技术使用户能够将细胞的迁移行为与细胞损伤区分开来。 

16、 Culture-Inserts 插件能否用于蛋白质涂层表面？ 拔出 Culture-Insert 插件会干扰涂层吗？

一般来说，只要涂层干燥，Culture-Insert 产检可以放置在涂层表面上。 请注意，插件不会黏附在潮湿的表面上。

但是，我们强烈建议您提前测试插件移除是否会破坏迁移间隙中的涂层。 您可以使用针对涂层蛋白的荧光标记抗体来分析这一点。 如果迁移间隙区域的涂层发出的荧光信号与开放孔中的一样均匀和强烈，那么您可以假设在移除插件后涂层是保持完好的。 经过几次成功的测试后进行实际实验通常是安全的。

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