液相色谱仪出峰不佳，峰分叉的原因

液相色谱仪出峰不佳，峰分叉的原因

液相色谱仪峰面积重复性不佳是什么原因

做液相色谱的同学基本都会碰到分叉峰，

很多时候，

这都意味着硬件或者方法某些地方可能出现问题。

今天我们就一起看看导致峰分叉的原因，

以及如何解决这个问题。

首先，我们需要判断，

这到底是一个峰，还是两个峰?

a图主峰前面有一个肩峰，

这到底是峰形不好，

还是另外一个化合物没分开呢?

判断方法

降低该成分在样品中的浓度

b图是降低该成分浓度后，

进样后得到的色谱图。

如果这是一个峰，

那肩峰也应该响应变小，

但是这个例子里，

肩峰没有变小，

这应该是另外一个化合物。

这时候，我们就要考虑如何改变方法

将这两个东西分开。

如果所有峰的峰形都不好

一般来说，

一个样品都会出多个峰。

峰形不好，绝大多数时候

在每个峰上面都会出现。

比如像下面这样：

a图是所有峰都拖尾，

b图是所有峰都有肩峰，

也可以说峰分叉，

这种情况一般都是色谱柱头塌陷

或者柱头的筛板被堵导致的。

为什么会导致峰形问题呢？

请看下面的图

a图是正常的柱头，

b图是筛板被堵的柱头。

正常情况下，

所有样品分子都是均匀通过色谱柱，

形成一个对称的峰形。

堵塞的情况下，

有一部分样品分子进入色谱柱就会受到阻扰，

导致时间拖后，形成拖尾。

对于色谱柱塌陷的情况，

用同样的方法大家也不难理解。

只不过这时候，

是一些样品分子可能跑的比正常的快了一些。

如何解决这个问题呢？

1  反冲

柱出口放空，

冲20-30ml流动相。

虽然柱子上都有表明使用方向，

但是对于硅胶基质的色谱柱

基本都可以反冲。

将柱头污染物

如泵密封圈的碎屑，

样品中的污染等冲走，

就能解决问题。

当然，还是要提倡大家注意

样品上机之前的前处理

和及时更换磨损的泵密封圈。

有条件的还是用保护柱，

大不了就换保护柱，

也比换色谱柱强。

2  更换或清洗筛板

现在估计做这个事情的人不多，

但是谁有废柱子，

想练练也未尝不可。

我们一起看看一个实际的例子

根据之前说的，

可能是柱头堵了，

或者塌陷了。

但是进一步检查，

发现另有原因。

方法用的150 mm 4.6 mm, 5 um C18 柱子，

78% 乙腈，1.5ml/min，等度方法，

进样10ul，100%乙腈溶解的样品。

一般来说，

虽然10ul的纯乙腈不会引起峰形不好，

但是有时候样品溶剂的极性跟流动相差异较大时，

的确会引起峰形的问题。

我们怎么办呢？

01

从最容易的办法做起，

降低溶剂乙腈的比例，

降到50%看看。

从下图b，4min的峰可以看出，

没啥改观。

02

接下来反冲柱子，

结果如图c，

基本没变化。

算了，明天再说吧。

03

第二天来到实验室，

还能干嘛呢? 

更换筛板?

算了，直接换柱子吧！

结果如d，

噢，好很多噢。

之前柱子肯定有问题，扔了。

但是峰还是有点宽，

估计还是哪儿有问题。

手上忙，没时间管这个。

04

几天过后，

重新配了流动相，

一跑，好了，如图e。

虽然到底什么原因导致之前峰形的问题，

已经无从查找

（柱子扔了，旧流动相也没了），

但是也给我们提供了一个解决问题的步骤：

1

确定峰形问题

是所有峰都有问题，

还是就是某一个峰有问题。

如果所有峰都有问题，

基本都是色谱柱，

或者仪器管路连接的问题。

如果是某一个峰有问题，

那就要从方法上来考虑，

是否需要改变流动相比例，

pH值，色谱柱温度等等。

2

从最简单的做起

从不需要换什么东西的方法做起。

比如改变样品溶剂，

反冲色谱柱等等。

3

换东西

换保护柱，换色谱柱，

换流动相(新配)，

一步一步的换，

有助于找到问题的根本。

4

总结经验

问题解决后，

想想需不需要采取什么措施，

防止类似问题的发生，

比如说常换流动相啦，

及时更换密封圈啦，

记录进样次数

了解什么时候色谱柱就不行了啊之类的。

希望以上信息能够让各位同学

在碰到峰形不好的问题时，

有一些思路，

不至于手足无措。

也欢迎大家留言补充

上面没有提到的可能影响峰形的可能。

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1.4.如果峰形解析不正确（未完全分离的重叠峰），可能会被误认为柱（色谱柱）或缓冲液的问题。

如果仅部分解析两个峰形（两个峰仅有部分分开），则可能会认为其是裂峰或双峰。如图4显示的情形。

在图4a中，可观察到与图3极为类似的峰值变形（峰变形），其表明玻璃料被堵塞（筛板堵塞）。

改变柱并未纠正这个问题（更换色谱柱不能解决此问题），所以玻璃料（筛板）堵塞并非导致这一现象的原因。如果柱上样品的质量减少（减少上样量）（图4b），峰形看起来更像是两个峰，而不是一个肩形峰。

这便需要进一步研究，以确定是否存在第二个峰。可以通过修改方法条件来完全分离两个峰（由此进行了进一步的研究，证实了存在第二个峰。

调整方法的条件后，两个峰完全分离）。

图4. 由于存在第二个组分而产生分裂峰。

（a）25ng / mL，和（b）等离子体中10ng/ mL的药物（第二个峰）（10 ng/mL血浆中的药物（第二个峰））。来源[1]。