使用显微镜观察和判读H&E染色

分辨组织样本的结构，了解显微镜在病理学应用中的多种功能

谈到显微镜在病理学家日常工作中的用处时，我们通常会想到诊断。除了病理学实验室工作流的这一阶段，显微镜在更早期的阶段也发挥着重要作用。实验室技术员或病理学家使用显微镜检查样本染色情况。

如果样本不经染色处理，在显微镜下只能看到组织切片或涂片标本的基本结构，但却无法看到进一步的细节。对于对比度不足的非常薄的切片尤其如此，有时几乎是半透明状态。 

图1：图像中所示为未染色的组织切片。没有苏木精和伊红等染色，几乎无法识别不同的细胞类型或组织结构，也就很难从图像中获取有用信息，甚至无法进行有效的诊断。

经染色处理后，样本的不同部分显示为不同的颜色和染色强度，从而使组织内的结构可见。最常见的染色组合是苏木精和伊红，简称为H&E染色。

图2：载玻片浸入不同的溶液中进行染色。

H&E染色的原理

H&E染色前，首先要对组织进行固定、脱水、包埋和切片处理，然后将切片贴到载玻片上。染色前，一般需要使用二甲苯等溶剂移除包埋介质，通常为固体石蜡。然后将切片通过分级醇溶液，降低浓度并置于水中对切片补水。

在下一步中，将切片浸入苏木精溶液中，对细胞核进行染色。染色的强度取决于组织类型、切片厚度、浸泡时间等因素。观察玻片的病理学家的偏好也有影响。用水冲洗后，用蓝色染色液将苏木精的红染色变为蓝色。 

图3：图中显示了40倍放大倍率下十二指肠内的细胞核。它们使用苏木精染为蓝色。尽管组织内的细胞很密集，伊红产生的淡粉色染色依然能够显示组织内的皱褶和其它结构。

检查强度和背景染色

在显微镜下快速观察后，实验室技术员或病理学家便可判断染色是否充分或过度。如果染色不充分，便需要在苏木精中再次浸染。如果染色浓度过强，切片显示背景染色，他们会使用酸性溶液淡化染色，实现切片染色的差异化。这一步骤后，需要再次使用蓝色染液并在自来水下冲洗。 

下一步是伊红染色。伊红是苏木精的复染剂，可差异化地染出红细胞、胶原，并通过粉色展现出平滑肌。分化同样需要根据组织的情况用水洗去过量的伊红。然后将染色后的玻片浸入梯度乙醇中，再浸入二甲苯，对玻片脱水。完成染色和脱水后，使用封片剂来封装切片。 

何时检查染色 

究竟是在苏木精染色后在显微镜下检查染色和分化，还是在伊红染色后，不同的方案做法也不同。在苏木精染色后检查，无论是再次浸染还是重复分化，都方便立即调整。在伊红染色后检查，可以让实验室技术员或病理学家对全染色玻片有一个更好的了解。 

快速检查在实验室工作流中具有重要的作用，可以确保负责诊断的病理学家看到需要的细节信息。

可见结构

使用明场照明可以观察H&E染色玻片。苏木精将细胞核染为蓝紫色，伊红将细胞质和结缔组织染为浅粉色。借助染色，病理学家可以轻松辨别不同的组织类型，例如肌肉或结缔组织，并发现切片中的畸形或不规则情况。这可以帮助它们识别反应特定的病理的变化，例如感染、慢性炎症或恶性肿瘤。借助可见信息，病理学家可以观察到组织内的结构变化，从而确定疾病的性质和进展。

图4：5倍放大倍率下的总览图显示了十二指肠中的三层组织：浆膜、粘膜下层和粘膜区域。每个区域对苏木精和伊红会有不同的反应，因此借助染料可以轻松辨别边界层。为识别潜在病灶，关键是要准确确定发生病理变化的确切组织部位和细胞类型。

图5：40倍放大倍率下的十二指肠显示了粘膜下层和粘膜区域之间的边界。通过H&E染色，可以轻松辨别不同的细胞类型。一种细胞突破两个组织隔室之间的天然障碍，通常为癌症进展的一种常见指示。

颜色差异

染色工作流和诊断中使用的显微镜需要可以很好的辨别颜色差异，这对及时、准确的诊断至关重要。检查染色时，通常使用小尺寸的独立正置显微镜，因为实验室工作台一般都比较拥挤。 

诊断使用的显微镜则应配置性能优异的相机，以便拍摄到报告和归档所需的细微的颜色差异。注释功能也有助于创建报告。如果您想了解更多关于适当临床显微镜的信息，可以阅读文章“如何选择临床显微镜”。

推荐阅读：

· P. Zorzi, C. Müller, Factors for Selecting Clinical Microscopes, Science Lab (2022) Leica Microsystems

· M. Barszczewski, P. Zorzi, P. Laskey, C. Müller, Clinical Microscopy: Considerations on Camera Selection, Science Lab (2022) Leica Microsystems

· C. Alwssandro, How to Benefit from Digital Cytopathology, Science Lab (2022) Leica Microsystems

· P. Zorzi, C. Müller, The Time to Diagnosis is Crucial in Clinical Pathology, Science Lab (2022) Leica Microsystems

相关产品

本文节选自《实验卒中手术学》主编：杨国源

书号：ISBN 978-7-5046-6264-4/R·1648

1.冰冻切片苏木素伊红染色

1、将4%多聚甲醛灌注后的大脑，用冰冻切片机切片，厚度为10~40微米。

2、将脑片贴在载玻片上，并且吹干过夜。

3、将脑片脱脂（若是脑组织直接冰冻，则不需要脱脂）：

       （a）将脑片浸没在氯仿和乙醇混合物中至少1小时。

       （b）将脑片分别在、95%、70%和50%的乙醇中各浸泡5分钟，然后用蒸馏水冲洗。

注意：必须等到片子完全干燥（没有水滴）。如果脑片是几天前准备的，在染色之前必须放到蒸馏水中浸泡5分钟。

4、染色步骤：

       （a）将苏木素滴在脑片上，染色20~25分钟。整个过程用眼睛或显微镜观察，保证细胞核变蓝。

       （b）用蒸馏水洗2次。

       （c）用0.25%的氨水溶液轻轻冲洗约10秒。

       （d）用蒸馏水洗2次。

       （e）用伊红染色10秒

       （f）用蒸馏水洗2次。

       （g）用70%、80%、90%、95%、的乙醇脱水1次，每次3分钟。

       （h）用乙醇与二甲苯混合液脱水3分钟。

       （i）用二甲苯处理5分钟

       （j）滴2~3滴封片剂，用盖玻片封住脑片，准备在显微镜下观察。

2.石蜡切片的苏木素-伊红染色

1、修剪组织：如果大脑固定在4%6的多聚甲醛里，那么修剪组织必须在通风橱里进行。去除小脑和嗅球部分。大脑用水冲洗干净，冠状切片切成3份。组织放在生理盐水中。

2、处理以及石蜡包埋：在自动包埋机上进行包埋。金属盒放在机器中过夜。组织进行梯度脱水，并用石蜡进行包埋。

3、组织包埋的步骤:

       （a）加热温度控制在59~61℃；

       （b）样品控制台温度在59~61℃；

       （c）冷冻台温度为5℃；

       （d）组织转移到加热台上，浸在石蜡中，然后移至样品控制台。

注意：不要把样品放反了，同时要保持它们的方向一致。把铁块放在冷冻台上，冷却20分钟。

4、室温下在切片机上切片：

       （a）水浴温度控制在45~50℃。

       （b）石蜡组织放在冰水混合物中。

       （c）室温下设置好切片机。

       （d）45℃，吹干载玻片20分钟。

       （e）蜡块固定在切片机上，修整蜡块表面，直至大脑组织出现。

       （f）切片，厚度可根据试验要求，切成4~10微米。

       （g）脑片转移到水浴中，然后贴在载玻片上。

5、预染：载玻片在60℃的烘箱中烤片15分钟，融化石蜡，使乙醇挥发。注意用架子架住载玻片。

6、HE染色：可以自动也可以手动进行。

1）自动：染色在染色机中进行，依次用以下溶液处理：

       （a）3次二甲苯；

       （b）2次乙醇；

       （c）2次95%乙醇；

       （d）苏木素染色；

       （e）2次95%乙醇；

       （1）70%乙醇；

       （g）伊红染色；

       （h）70%乙醇；

       （i）3次二甲苯。

2）手动：每一步骤约1~2分钟，整个过程需要25~30分钟。载玻片放入盒子中，滴2~3滴封片剂，然后用盖玻片小心地盖在上面。

① 注意事项：

       （a）封片前片子不要干燥，封片剂将地封住脑片；

       （b）在完全干燥之前保证片子平整；

       （c）在显微镜下观察片子的染色效果。例如：如果组织在冰盒中的浸泡时间不足够长，组织看起来会有皱褶。如果漂片温度太高，片子会碎，如果温度太低，片子不能漂浮。

② 手动的HE染色方法：

       （a）3次二甲苯，每次2分钟，脱去脂肪和蜡；

       （b）乙醇，每片10滴；

       （c）95%乙醇，2次，每片10滴；

       （d）蒸馏水洗；

       （e）苏木素染色15分钟；

       （f）蒸馏水洗2次；

       （g）0.25%氨水洗，直至组织变蓝；

       （h）蒸馏水洗2次；

       （i）0.5%的伊红染色，每片10~20滴；

       （j）95%乙醇，洗2次，每片10~15滴；

       （k）乙醇，每片10滴；

       （l）3次二甲苯，每片10滴。

苏木素伊红染色后细胞核呈蓝色，细胞质呈粉红色或红色。如下图所示：

文末福利

扫描下方二维码，申请SYRFLSI Ⅲ激光散斑血流成像系统，造模完毕即可检测造模效果。点击查看大脑中动脉缺血模型的操作步骤。

提交申请后7个工作日内

我们的工作人员会与您联系

显微镜相机应用于HE染色观察

HE染色可看大体病理改变，用染料把碱性和酸性物质直接染成蓝色或红色，显微镜下可直接观察组织或细胞的形态。在临床上是诊断恶性肿瘤和肿瘤的很好的方法。生物显微镜ML31用于HE染色观察，具有易用舒适，稳定可靠的优势。

近期，明美广州区域安装生物显微镜ML31搭配630万像素显微镜相机MS60，用于HE染色片的观察并能清晰拍照。在显微镜下做诊断其实并不容易，这需要大量知识的学习和丰富的经验积累，而好的显微镜能有效提升效率，ML31采用高平场性物镜，保证10X/22视野数下的平坦清晰成像。

生物显微镜ML31采用人机工程学设计，不断为操作者更加提供好的使用体验，避免长期使用带来的疲劳感；另外通过光学系统优化升级，使得操作更简便，减少培训成本，易上手。

生物显微镜ML31采用高透光平场消色差物镜，成像清晰无场曲，标配明场成像，无限远光学系统，扩展潜力大，可扩展用于暗场、相差、荧光多功能显微观察。

您若对生物显微镜感兴趣或存在疑问，欢迎与我们联系，我们将竭诚为您服务！

免责声明

本站无法鉴别所上传图片、字体或文字内容的版权，如无意中侵犯了哪个权利人的知识产权，请来信或来电告之，本站将立即予以删除，谢谢。 

来源：https://www.mshot.com/article/1765.html

HE染色法又称苏木精—伊红染色法(hematoxylin-eosin staining)，是一种广泛用于临床和实验中的染色方法。将以苏木精染液和伊红染液先后将特定的细胞成分上色，由于苏木精染液为碱性，使细胞核内的染色质与胞质内的核酸着紫蓝色；伊红为酸性染料，使细胞质和细胞外基质中的成分着红色。通过HE的染色，各种组织或细胞成分与病变的一般形态结构特点均可显示出来，HE染色法是组织学、胚胎学、病理学教学与科研中最基本、使用最广泛的技术方法，一般搭配生物显微镜进行观察。

近期潮汕职业技术学院老师需要一台显微镜和相机对HE染色切片进行观察，且需要拍照以及录像功能模块，明美销售经理推荐生物显微镜ML31搭配显微镜相机MSX1

生物显微镜ML31搭配显微镜相机MSX1拍摄的HE染色片

生物显微镜ML31是一款采用无限远光学设计的高倍放大显微镜，配备平场消色差物镜和长寿命LED透射光源，柯勒式照明，可以获得清晰、平坦、高衬度的成像效果，可以用来观察植物切片、植物细胞，或者半透明物体以及粉末、细小颗粒等样品。

显微数字相机MSX1采用高性能成像芯片，内置MS系列硬件ISP图像处理芯片，针对显微镜拍摄场景特别优化，精确还原样品的精细结构和真实色彩，通过硬件加速，极大提升了相机运行速度，是病理诊断、金相分析和体视观察等应用领域的理想工具。

如果您对HE染色片显微镜感兴趣或有疑问，欢迎与我们联系，期待与您相约！

来源：http://www.mshot.com.cn/kehuanli/2023131.html，转载请保留出处，谢谢！

癌细胞在显微镜下是什么样的？

癌细胞是正常细胞基因突变的结果，其反应和行为异常，没有正常细胞的寿命限制，充当攻击某些身体部位的侵入性生物，导致肿瘤和继发性恶性生长。通过显微镜观察可研究如何对癌细胞进行靶向研究。

某医院需运用荧光显微成像技术对癌细胞进行靶向研究和评估，明美工程师推荐了倒置荧光显微镜MF52-N, 配备数显LED荧光模块，可即开即用，可实现相差观察、荧光观察和明场观察，满足不同的应用；可个性化选择荧光通道，实现多种荧光信号观测。呈现效果用户满意。

倒置荧光显微镜MF52-N可选高灵敏度相机，弱荧光信号捕获能力强，成像效果优异。此次搭配2000万高像素高清相机MDX10，分辨率调高，灵敏度良好，针对显微成像深度优化，成像清晰。

倒置荧光显微镜MF52-N可应用于细胞组织，透明液态组织的显微观察，也可用于生物制药，医学检测、疾病预防等领域内的荧光显微观察。

您若对显微镜感兴趣或存在疑问，欢迎与我们联系，我们将竭诚为您服务！

免责声明

本站无法鉴别所上传图片、字体或文字内容的版权，如无意中侵犯了哪个权利人的知识产权，请来信或来电告之，本站将立即予以删除，谢谢。

来源：https://www.mshot.com/article/1586.html

一、荧光基础知识

在显微成像中，荧光指的是一种光致发光现象，某些分子能吸收特定波长的光线，然后再发射出其他波长的光线的物理现象，这种分子一般称为荧光团。通常情况下，由于斯托克斯位移，荧光团的激发峰值和发射光谱之间存在差值，发射光线能量低于吸收光线，波长比激发光更长。

荧光现象有两种：自发荧光与继发荧光。自发荧光也称固有荧光，是指经照射后就能发出荧光；继发荧光也称二次荧光，物质经照射后不能或只能部分发生微弱荧光，需先用荧光染料标记处理，再经照射才能发生荧光。目前在荧光显微技术中，主要利用的是继发荧光现象。

念珠藻叶绿体的自发荧光，明美MF52-N拍摄

荧光产生包含激发和发射两个过程，在荧光显微技术中具体体现为以下几个关键部件：

（1）激发光源：主要包含以下两个指标

Ø 光源光谱覆盖发射光谱：荧光团在特定波段范围才能被大部分激发，因此激发光源的光谱范围要能匹配所观察样本中的荧光团激发特征。

Ø 发射光谱波段的强度：荧光信号一般较弱，需要使用较高亮度的激发光以产生较强信号的发射荧光信号。

（明美-四通道LED光源MG120，宽光谱 + 高光功）

（2）激发块：用于形成特异性激发/发射的一组滤光片，一般包含以下三个

Ø 激发滤光片EX：滤过光源中特定波段的光，用以激发样本中特定染料

Ø 发射滤光片EM：允许荧光团发射的特定波段的光通过

Ø 二向分色镜DM：反射激发波段的光，透过发射波段的光。透射荧光显微镜没有这个滤光片，但目前主流都是落射荧光显微镜，会有二向分光镜。

（明美可定制适配四家品牌，不同波段需求的激发块）

二、荧光显微成像的应用

荧光显微镜利用自发荧光或继发荧光现象，广泛用于生物（医学）、矿物、材料科学等领域的显微荧光观测。①在生物学领域，主要借助荧光染料标记，可准确和详细地识别细胞和亚微观细胞成分。②在矿物学领域，通常用于研究有自发荧光特性的物质，如石油、煤炭、氧化石墨烯等矿物。③在材料科学，可用于纺织工业或造纸业来分析基于纤维的材料，包括纺织品和纸张，在半导体领域，也可用来观测具有荧光特性的材料如磁珠等。

明美MF31-LED荧光显微镜观察SBS改性沥青

（MF43-N拍摄的磁珠荧光图片）

荧光显微技术在生物学领域中应用是广泛也是复杂的，主要是对细菌、细胞、组织或小型生物（如斑马鱼等模式生物）进行标记成像，它的微观层面都是通过荧光染料对分子层面进行标记。从荧光染料的选择看，通常需要考虑几个因素，一是荧光染料标记的位置，二是该染料对应的激发特征，包括吸收光谱特征和发射光谱特征。借助荧光染料，荧光显微技术不只局限于蛋白质，它还可以对核酸、聚糖进行染色，甚至钙离子等非生物物质也可以检测。以下根据染料结合的位置列举了一些常见的荧光染料及应用范围：

FITC荧光染色，MF52-N拍摄

（1）免疫荧光（IF）：主要标记的是蛋白质。免疫荧光技术利用抗体可以和相应抗原特异性结合的特性，主要有两种方式：一是利用内源荧光信号，即通过克隆技术用遗传学方法将荧光蛋白与目的蛋白相连，如GFP等；二是利用荧光标记的抗体与目的蛋白特异性结合。

Ø FITC（异硫氰酸荧光素）：是一种有机荧光染料，495/517 nm为该染料激发/发射峰值，可以和蛋白质上的基团结合，主要用于免疫荧光和流式细胞术中。

Ø TRITC（四甲基罗丹明-5(6)-异硫氰酸）：属于罗丹明家族的衍生物，550/573 nm为该染料激发/发射峰值，可与蛋白质结合。

Ø 花箐染料（cy3、cy3.5、cy5、cy5.5、cy7等系列）：非特异性吸附少，消光系数高，荧光量子产率高，从而让标记显影时背景弱，信号强。除细胞显影外，它们也常用于生物筛选、蛋白免疫印迹、生物医学显影、小动物体内成像等。

Ø Alexa Fluor系列：属于带负电荷且亲水的荧光染料系列，是不同基础荧光物质的磺化形式。这些产品标识涵盖了对应的激发波长，相比于FITC等染料，具有更好的稳定性和荧光亮度。

DAPI荧光染色，MF52-N拍摄

（2）DNA染色：主要标记核酸。同蛋白质一样，对核酸进行标记与研究同样有重要意义，如对细胞核（主要成分为核酸）进行染色标记可以判断细胞的数量和位置。

Ø DAPI（4',6-二脒基-2-苯基吲哚）：当DAPI与双股DNA结合时，在358nm处有一个吸收峰值，在461nm处有一个发射峰值，其发射光的波长范围含盖了蓝色至青绿色。DAPI也可与RNA结合，但产生的荧光强度不及与DNA结合的结果。DAPI可以透过完整的细胞膜，因此被广泛用于活细胞和固定细胞的染色。

Ø Hoechst（33258、33342、34580）：这三种染料都可在350nm左右的紫外光激发，在461nm处发出蓝靛色荧光。与DAPI类似，Hoechst可透过完整细胞膜，被广泛用于活细胞和固定细胞染色。

Ø PI（碘化丙啶）：是一种不能透过细胞膜的DNA染色剂。与核酸结合后，激发波长为538 nm，发射波长为617 nm。由于该染色剂无法进入完整的细胞中，因此该染色剂常用于区分细胞群中的活细胞和死细胞。

Fura2钙离子探针做的研究图片， 引自公开文献
Front. Neural Circuits 11:11. doi: 10.3389/fncir.2017.00011

（3）离子成像：研究细胞中各种离子的流动与分布对细胞活动的深入理解有重要作用。通过各种离子指示剂，如钙离子、钠离子、镁离子、锌离子等指示剂与离子结合形成荧光团，利用光谱特征检测对应离子的分布状态。

三、荧光显微成像的挑战

应用荧光显微技术进行成像的过程中，不仅要考虑成像的质量，包括分辨率、对比度、荧光信号强弱、背景光、多通道成像等，还要考虑荧光染料、光照等对样本的影响，比如荧光染料毒性、光毒性、光漂白等。以下列出了荧光显微技术应用中的常见挑战与应对方法：

汞灯需搭配带计时器的复杂控制箱来使用

（1）激发光源选择和使用。传统荧光成像使用的是高压汞灯，具有特异性的光谱特征和较高的光强，但使用有很多麻烦，首先需要预热，然后光强靠ND滤镜调节，寿命较短可能就200小时，在寿命用完前还会有光强衰减问题，需要调整ND滤镜，替换灯泡后需要重新校中。目前很多应用都用LED荧光光源取代汞灯作为荧光光源，如宽光谱大功率LED荧光光源MG-100，寿命长单个可以顶50个汞灯，光强更稳定可控，并且可以即开即用，省事省心。

明美可定制适配四家品牌的滤光片组

（2）滤光片质量和匹配度。激发块中的滤光片质量会影响激发光和发射光的透过率，影响荧光效率并带来杂散光和背景噪声问题。同时，滤光片的参数能否匹配染料的激发峰和发射峰，也会对荧光效果产生重大影响。对于简易荧光需求，明美建议使用数显荧光模块，整合光源和BGU等常用激发块，可以为四家品牌显微镜升级荧光观察，简单易用效果好。对于专业荧光需求，明美提供匹配四家品牌主流荧光显微镜的激发盒和滤光片组，可按需定制不同滤光片组合，如钙离子Fura2探针需要用U激发G发射，一般的U激发B发射滤光片组并不适合。

（MF43-N+MC50-S拍摄的小鼠脑片荧光图像）

（3）光毒性与荧光染料毒性：在生物学领域的荧光成像中，需考虑光毒性与荧光染料毒性对样本的影响，如细胞内的有机分子在与氧反应时吸收光发生分解并产生自由基，部分荧光染料本身也能产生自由基，这是引起细胞等生物样本损伤的主要来源。通常的应对思路是：①使用具有较低能量（波长较长）激发光谱的荧光染料；②尽可能低的光强和尽可能短的激发时间，需要在成像质量与样本健康之间保持平衡；③降低帧速率，尤其在长时间的荧光成像中，这种情况需要提高相机的灵敏度，保证捕获微弱的荧光信号。

（单通道荧光拍摄，经软件合成多色荧光图像）

（4）多色荧光成像：在生物学领域应用较多，尤其是在对活细胞标记成像时，需同时对多种物质进行标记，并在一个图像中显示，而大多数荧光染料具有宽发射光谱，在使用多种染料标记时会出现荧光光谱重叠现象。对于多色荧光成像，有两种应对思路，一是针对每种染料使用对应的单通道窄带滤光片，后通过软件进行合成，这种方式对成像速度及软件图像处理提出较高要求；二是使用宽光谱光源同时激发，选用双通滤光片或多通滤光片，这种滤光片的的特点是允许两种或以上波段荧光信号通过，可实现一组滤光片同时观察两种或以上荧光染料，这种方式要求相邻的发射光谱范围没有重叠，所得到的荧光信号之间能较好的被区分。

（双通滤光片荧光拍摄，镜下可同时观察到B\G两种荧光信号）

来源：https://www.mshot.com/article/1527.html