有关实验“DNA的提取及检测”的问题

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  aaaaa44444a4 2010-12-21 00:00:00

  实验准备工作： 1 所用离心管、枪头要洗净、烘干（Z好灭菌）。 2 试剂配制： 1 M Tris-HCl (pH 8.0): 称取Tris-Base 121g， 加入约800 ml 水在磁力搅拌器上搅拌，使其充分溶解后加入浓盐酸调整pH至8.0后加水定溶至1000 ml. 灭菌后于室温保存。 0.5 M EDTA (pH 8.0): 称取EDTA-Na2盐 187 g 加入约 800 ml水，在磁力搅拌器上边搅拌边加入固体NaOH，当EDTA和NaOH均完全溶解，溶液变清时其pH值刚好达到8.0左右，再用pH试纸略加调整即可， 灭菌后于室温保存。 5.0 M NaCl: 称取NaCl 300 g， 加入蒸馏水约800 ml 于磁力搅拌器上充分搅拌，约5分钟后停止搅拌，静止2~3分钟，倒出上清液，再加入100 ml蒸馏水重复前面的步骤，直到NaCl充分溶解后定溶至1000 ml.， 灭菌后于室温保存。 酚：氯仿：异戍醇（25：24：1）的配制：可参考《分子克隆》亦可按如下方法配制取重蒸酚100 ml ，蒸馏水50 ml，8-羟基喹咛0.05g 加入500 ml玻璃烧杯于磁力搅拌器上边加热边搅拌，待酚达到水饱和后加入18 g Tris-Base，等Tris-Base 完全溶解后加入100 ml氯仿：异戌醇（24：1），搅拌10~20分钟，静止约10分钟，除去上层水相后，装入棕色瓶，Z后加入20 ml 0.1M的Tris-HCl保护液于4℃保存。 DNA Buffer的配制： 1 M Tris-HCl (pH 8.0) 100 ml 0.5 M EDTA (pH 8.0): 100 ml 5.0 M NaCl: 300 ml H2O 500 ml 灭菌后于室温下保存3个月左右，用时按1.5%往Buffer中加入CTAB，在电炉上烧开；在通风橱里加入1%的巯基乙醇( 现配现用)。 DNA的提取： 1 取2~5 g叶片或愈伤组织，加入适量液氮研碎，转入预冷的50ml离心管，加入20 ml DNA提取缓冲液充分摇匀，于65℃水浴60~90 min，中途轻轻摇匀两次。 2 加入15 ml 氯仿：异戍醇（24：1）轻轻摇匀10分钟，于BECKMAN离心机中4000 rpm离心15分钟。 3 取上清液于另一50 ml离心管加入10 ml 氯仿：异戍醇（24：1）重复步骤2。 4 吸上清液于一干净的50 ml 离心管，加入15 ml 冷冻的异丙醇，轻轻摇匀后于-20℃冷冻半小时，4000 rpm离心10分钟。弃上清液，加入5 ml 76%的乙醇（含10 mM NH4Ac）浸泡5 h（或过夜），中途换乙醇2-3次。 5 弃乙醇风干沉淀约半小时，加入3.0 ml TE缓冲液（10 mM Tris-HCl pH 8.0；1 mM EDTA ， pH 8.0），20 µl RNase A（10 mg/ml），37℃温浴过夜。 6 溶液转入一10 ml离心管，加入3.0 ml苯酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）充分颠倒混匀，4000 rpm离心15 min，吸上清液于另一10 ml的离心管中，（可重复一次）。 7 加入1 ml 5.0 M的NaCl和3.0 ml水饱和，充分混匀，4000 rpm离心5 min。 8 弃，用20 µl枪头挡住离心管管口内侧，用力下压枪头，使枪头与管壁间形成一狭缝，让下清液从缝中流入另一10 ml离心管。 9 加入5 ml冷冻的异丙醇，轻轻摇匀后于-20℃冷冻半小时，4000 rpm离心10分钟。弃上清液，加入3 ml 70%的乙醇浸泡4~6 h（或过夜），中途换乙醇2-3次。风干乙醇，加入500 µl TE溶解，或浸在乙醇中长期保存。 DNA检测 1 取DNA原液15 µl稀释至3.0 ml，用UV-1601型紫外分光光度计测定230 nm、 260 nm及280 nm的吸光值。 高质量的DNA要求：A260/A230>2.0； 1.7<A260/A280<1.9 2 将DNA原液适当稀释后，用1 Χ TAE，0.8%琼脂糖凝胶2V/cm电泳1 h进行质量检测。 3 向一定量的DNA中加入限制性内切酶EcoR I至4-5U/μg DNA，37℃消化过夜，用0.5 Χ TBE，0.8%琼脂糖凝胶2.5V/cm电泳3 h进行检测。 CTAB法微量提取DNA 1. 药品的配制: CTAB提取液： (1)100mM Tris-HCl(PH 8.0)，1.5M NaCl，50mM EDTA(PH 8.0) (2)1% PVP，2% CTAB (3)取少许(1)加到(2)中，搅拌成糊状，后加(1)至足量，65℃水浴充分溶解备用。使用前要在65℃温浴一会儿，然后加入1-4%巯基乙醇，混均匀。 苯酚：氯仿：异戊醇（25∶24∶1）： 重蒸酚65℃水浴溶解，在烧杯中加入80ml温热的蒸馏水，加入少许8-羟基喹啉，溶解后加入100ml重蒸酚，再加入100ml氯仿：异戊醇（24：1），加入20克Tris Base，磁力搅拌器上搅拌1.5 h左右至停止搅拌后很快分层，然后装入棕色瓶中，4℃冰箱中储存备用。 2. 材料的采取与保存： 在超净工作台上，取试管苗叶片，放入无菌的1.5 ml离心管中，置于冰盒中，然后把装有叶片的离心管一起装在纱布袋中，置液氮中冷冻10分钟，取出后置于—70℃冰箱中可长期保存，需要用时，取出置于冰盒中。 3．DNA的粗提 在装有叶片的离心管中加入石英砂少许（约0.07克），用事先灭过菌的—20℃冰箱中预冷的尖头玻棒将材料戳到底部，先压后研磨，研细后加入600 ul CTAB提取液，再继续研磨一会儿使其悬浮均匀，然后在65℃水浴锅中温浴60-90分钟，隔30分钟取出上下轻轻颠倒几次，水浴之后，加入700ul苯酚：氯仿：异戊醇（25：24：1），，上下晃动10分钟以上，其间置于37℃水浴锅中温浴一会（冬季），使之充分混匀，然后10000-12000rpm离心5-10分钟，吸取上清液转至另一离心管中，加入60 ul 5M NaCl，再加入-20℃冰冻无水乙醇1ml，轻轻颠倒数次，混合均匀后冰冻30分钟沉淀DNA，然后8000-10000rpm离心5分钟，弃上清液，加入1 ml 70%酒精浸泡2小时或过夜，8000rpm离心5分钟，弃酒精之后在工作台上风干DNA，注意不要过干，否则会使以后溶解困难。 4. DNA的纯化： 向风干后的DNA中加入500 ul 1xTE，37℃水浴15-30分钟至DNA完全溶解，然后加入700ul苯酚：氯仿：异戊醇（25：24：1），上下颠倒离心管约10分钟，至充分混匀，其间置于37℃水浴锅中温浴一会（冬季）；10000-12000 rpm离心5分钟，吸取上层液至另一离心管中，加入700ul氯仿：异戊醇（24：1），颠倒10分钟（方法同上），10000 -12000rpm离心5分钟，吸取上层液至另一离心管中，加入60 ul 5M NaCl，再加入1ml冷冻的无水乙醇，轻轻颠倒，然后在-20℃冰箱中置30分钟沉淀DNA，8000-10000 rpm离心2-3分钟，使DNA分散状紧贴在管壁上，弃酒精，加70%酒精1ml浸泡，2小时后换一次，后浸泡过夜，8000rpm离心3分钟后弃酒精，风干，加50-100ul1xTE充分溶解，然后每管加5ul 5mg/ml Rnase，37℃水浴6小时或过夜。 5. DNA检测: （1）0.8%琼脂糖凝胶电泳30-60分钟： TAE 100ml，EB 30ul，样品3-5ul，电压90V， 观察A：DNA是否跑出，带型是否整齐划一；B：RNA是否除尽 （2）分光光度计检测D260/D280的比值：在1.8-2.0的范围内认为纯度较高上述方法提取的DNA比值在1.65-1.95之间。浓度=30000xOD260（DNA样品为5ul时）。 不知道你说的是动物的还是植物的，我当年做的是动物的。用的是鸡血，因为在学校，没有生物书，只能粗略的查一下了 1、实验中两次使用蒸馏水。 diyi次，取血细胞液时加蒸馏水，目的是让血细胞吸水涨破 第二次是在析出含DNA的粘稠物后，目的是稀释NACL溶液，使DNA逐渐析出 2、加3次NACL， diyi次，在溶解核内DNA时，加入NACL后充分搅拌，加速染色质中DNA与蛋白质的分离，使DNA充分游离并融入NACL中 第二次在DNA粘稠物在溶解时，家NACL是使DNA再溶解 第三次是在DNA的鉴定中，目的是溶解DNA 3、过滤3次 diyi次在提取血细胞核物质时进行过滤，取得的滤液中含有染色质，而滤出的是细胞膜、核膜和细胞器等的破碎结构 第二次在滤去含有DNA粘稠物只能够，滤液中含有仍然溶解在NACL中的细胞中的一些成分，如蛋白质等 第三次在过滤含DNA的2mol/L的NACL溶液时，过滤后的滤液中含有DNA

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