ELISA试剂盒中的抗体有哪些

　　ELISA试剂盒中常用的方法类型!

　　ELISA是Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay的简称，即酶联免疫吸附测定，是研究蛋白抗体的重要方法。它采用抗原与抗体的特异反应将待测物与酶进行直接或间接结合，然后通过酶与底物产生颜色反应，进行定性和定量分析。我们一起聊聊常见的商业化ELISA试剂盒的方法种类以及它们各自的优势和用途：

　　ELISA大致分为五种类型：直接法、间接法、竞争法、夹心法、捕获包被法。在商品化试剂盒中用得比较多的是双抗体夹心法、竞争法和间接法。

　　双抗体夹心法是夹心法中的一种主要形式，我们先谈谈夹心法吧：

　　夹心法(Sandwich ELISA)分为双抗体夹心法和双抗原夹心法：

　　双抗体夹心法中抗原的2个不同的抗原表位被两个抗体-捕捉抗体和检测抗体，分别结合。捕捉抗体固定于载体即酶标板上，检测抗体通过结合抗原进行显色分析。应用于双抗体夹心法检测的捕捉抗体通常是单抗，偶尔有用多抗做为捕捉抗体的情况，但很少见，因为以多抗作为捕捉抗体容易出现交叉反应而降低特异性。检测抗体通常为多抗，在商业化的科研试剂盒中经常用到生物素标记的山羊多抗，再让生物素标记的多抗与HRP标记的亲和素或者链霉亲和素结合，然后再加HRP也就是辣根过氧化物酶的底物，通常是TMB反应显色，这种方法是在传统的HRP酶标记抗体的双抗体夹心法ELISA中引入了生物素-亲和素放大系统。

　　不过也有用单抗做检测抗体的情况，尤其是在科研中。双抗体夹心法具有高灵敏度、高专一性的优势，但该法只适用于有多个结合位点的抗原检测，主要用于检测各种大分子抗原——例如在医学检测中测定HBsAg、HBeAg、AFP等疾病相关的，以及在科研中检测细胞因子等。由于双抗体夹心法特异性高，在检测过程中有时会将样本和酶标抗体同时加入进行反应，称为双抗体夹心一步法，因为操作时间短，在商业化生产中有很大优势。但双抗体夹心一步法要特别注意ELISA中的钩状效应(hook ffect)，因为此时如果样本中抗原含量过高会导致其与固相抗体和酶标抗体均有结合而无法形成“夹心复合物”，此时测出的结果将低于实际含量甚至是阴性结果。因此，如果使用双抗体夹心一步法测定样本中抗原含量时要注意测量的线性范围，另外使用高亲和力的单抗也可削弱钩状效应。

　　双抗原夹心法中抗原被包被于固相，检测样本中的抗体结合于抗原后，使用酶标的抗原进行结合及后续反应，可以用来测定样本中的抗体。双抗原夹心法的关键在于酶标抗原的制备，需要根据抗原结构进行设计，在医学检验上测定抗HBsAg抗体采用的就是此法，检测时被测样本不需要稀释即可直接进行测定，故此灵敏度相对而言高于我们随后要说的间接法。

　　竞争法也是一种很常用的方法，一起看看：

　　竞争法是用样本中的游离抗体/抗原与固相的酶标抗体/抗原竞争性结合的分析方法。当游离抗体(或抗原)浓度越高，则能与固定抗原(或抗体)结合的酶标抗体(或抗原)就越少，后续显色就越浅，即与对照相比，显色越浅，表示检测样本中抗体(或抗原)含量越高。该法特别适合小分子物质的检测也可用于检测比较不纯的样本，且重复性好，但是检测的灵敏度和专一性较差。竞争法测抗原常用于检测小分子抗原及半抗原，这类抗原通常缺乏两个以上的识别位点，不适用于双抗夹心法进行测定。该方法在商业化ELISA试剂盒中被广泛运用。

　　最-后再说说间接法，间接法只能用于测定抗体，主要用于疾病的诊断，其优点是只需要改变包被抗原，酶标抗体是通用的。间接法使用了二抗增加信号强度，也使抗体的选择多样化，然而间接法容易产生交叉反应。

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重组抗体，也被称为重组免疫球蛋白，是通过基因工程技术将抗体的基因在合适的宿主细胞中表达并生产出来的一类抗体。与传统的多克隆抗体和单克隆抗体相比，重组抗体具有更高的特异性和亲和力，并且可以针对特定的抗原表位进行设计和优化。

重组抗体的类型包括嵌合抗体、双特异性抗体、抗体片段和Fc融合蛋白等。下面一起来看一下他们各种的应用：https://cn.sinobiological.com/resource/antibody-technical/recombinant-antibody-overview

①嵌合抗体

1975年，杂交瘤技术的发现彻底改变了抗体研究和临床开发。然而，鼠源性抗体的疗-效受到人抗鼠抗体（HAMA）效应的限制，鼠源性单抗对人体具有异种蛋白的免疫原性 ,在人体内半衰期较短。1984年，研究人员通过基因工程构建了第一个嵌合抗体，也是公认的第一种重组抗体，以降低鼠源抗体在人体内的免疫原性。其中，约30%-35%的分子来源于小鼠的抗体序列，约65%-70%来源于人的抗体序列。所得嵌合抗体保留了亲代小鼠抗体的抗原结合能力。抗体嵌合是开发治-疗性人源化抗体的第一步。义翘神州采用CDR移植技术和计算机辅助分子建模，提供高质量的单克隆抗体人源化服务，成功率高，人源化程度>90%。

②抗体片段

每一个完整的免疫球蛋白（IgG）分子包含通过二硫键连接的两条重链和两条轻链。抗体片段（如Fab、scFv和VHH）体积小，比其全长抗体具有更好的组织或肿瘤穿透力。因此，它们在免疫治-疗方面具有巨大的前景，尤其是在实体瘤方面。此外，它们的半衰期也较短，可用作放射性显像剂。然而，由于缺乏Fc区，它们不能引起Fc介导的抗体效应功能，如抗体依赖性细胞毒性（ADCC）和补体依赖性细胞毒性（CDC）。

起初采用酶解法对IgG抗体进行片段化。胃蛋白酶作用于铰链区二硫键所连接的两条重链的近C端，水解产生被称为F(ab’)2的二价Fab片段。然后，通过木瓜蛋白酶将该片段裂解为两个相同的Fab片段。然而，酶解法限制了可制备的抗体片段类型，而且不适合工业化大规模生产和纯化。随着抗体工程技术的进步，这些问题可以通过重组生产抗体片段来解决。抗体基因克隆测序成功后，可通过瞬时转染在原核表达系统（如大肠杆菌）和哺乳动物系统（HEK293细胞）中表达抗体片段。

凭借丰富的重组生产经验，义翘神州建立了高通量VHH表达平台，交付了多个VHH抗体生产项目，总体成功率超过90%。除了常见的VHH形式，我们还可以表达双特异和多特异VHH。此外，义翘神州还可以表达其他各种高特异性和亲和力的抗体片段，如scFv和Fab。

③双特异性抗体

与常规单克隆抗体不同，双特异性抗体（bsAb）具有两个结合位点，可识别同一抗原上两个不同抗原或表位。由于这一特性，双特异性抗体备受研究者和制药业的关注。截止目前，美国食品药品监督管理局（FDA）已批准了4种双抗药物，而且160多种双抗正在进行临床试验，用于治-疗癌症、糖尿病、阿尔茨海默病和其他疾病。

起初，双特异性抗体通过四源杂交瘤技术制备，但这对下游抗体生产和纯化构成了巨大的挑战。随着过去20年重组DNA技术的发展，出现了几种双特异性抗体形式，以适应所需的靶标-产品特征。为了解决重链错配问题，Genentech首先提出了“knob-into-hole”（KiH）技术，该技术通过对CH3结构域进行改造，在每条重链中创建一个“knob”或一个“hole”，以诱导异源二聚化。同样地，研究人员也采用了common light chain 和CrossMab等其他技术来解决轻链错配问题。表达双特异性抗体主要在哺乳动物细胞中进行。由于单克隆抗体和双特异性抗体之间的各种结构相似性，许多已建立的常规单抗纯化工艺也可适用于双特异性抗体。（参见另一篇文章：“双特异性抗体：抗体治-疗中的新星”）

④Fc融合蛋白

Fc融合蛋白（又称Fc嵌合融合蛋白、Fc-Ig和Fc标签蛋白）是一种同源二聚体，由免疫球蛋白的Fc段与具有生物学活性的蛋白分子组成。虽然单克隆抗体是治-疗性生物制剂开发的重-点，但Fc融合蛋白也是一类成功的生物制药产品，至少有13种药物获得了欧洲药品管理局（EMA）和美国FDA的批准。除治-疗应用外，Fc融合蛋白还是基础研究中的检测试剂，包括流式细胞术、免疫组织化学和蛋白结合试验。事实上，与Fc区的连接可以提高一些结合蛋白的溶解度和稳定性。鉴于其大小和对糖基化的需求（大多数是糖蛋白），Fc融合蛋白主要在哺乳动物表达系统中产生。

目前，抗体工程技术取得了一定的进步，这极大地促进了各种形式重组抗体的开发，用于疾病治-疗。FDA已批准了100多种抗体药物，目前有多种抗体处于临床后期开发阶段。此外，重组抗体还可用于许多研究应用：蛋白免疫印迹（WB）、免疫组织化学（IHC）、免疫荧光（IF）、流式细胞术（FC）和表面等离子体共振（SPR）。

总之，重组抗体是基因工程技术的重要应用之一，其类型多样，具有广泛的应用前景。随着基因工程技术的发展，重组抗体的生产成本和安全性问题也将得到进一步优化，为临床治-疗和科学研究提供更多有效的工具。同时，我们也应该认识到重组抗体的潜在风险和挑战，加强对其安全性和有效性的评估和监管，以确保其能够更好地服务于人类的健康事业。

更多重组抗体详情关注：https://cn.sinobiological.com/news/recombinant-antibodies-formats

　　Elisa实验：Elisa如果加样，有哪些小窍门!

　　ELISA实验中，加样 一定是绕不开的一环!ELISA测定操作非常简单，一般涉及到样本的收集保存、试剂准备、加样、温育、洗板、显色、结果判断和结果报告及解释等方面，其中任一步骤的不当都会影响测定结果，且尤以加样、温育和洗板等步骤为甚。

　　ELISA实验中一般需要 4 次加样，即加样本、加检测抗体、加底物和加终止液。

　　● 实验室使用的微量加样器应注意保养并定期校正。ELISA比较敏感，每孔加入液体量误差会导致读数差别，因此避免仪器带来误差。

　　● 加样前，溶液充分混匀，加样时不可90度向孔中滴加液体，否则会导致液体残留在吸头上，加样不准确。正确加样方法应为45度，吸头贴着孔壁和液面的交界处加入。

　　● 加样品时，单孔用量要求：≥50ul/指标，如需要做复孔则所需样本量≥100ul/指标。如果样本量不充足，具体用量可咨询您的专属销售。

　　● 加样时速度不可过快，否则无法保证微量加样的准确性和均一性。

　　● 加样时避免液体溅出，如有样本溅出，应用吸水纸轻轻拭干，并做相应记录。

　　● 每次加样顺序一致，尤其底物、终止液顺序一致，保证每个孔显色时间相同。

　　● 加完显色液后，放入一个可推拉的抽屉内，就可以避光振荡了。

　　| 加样防错小窍门

　　● 用一张写满字的纸，字越多越好，比如报纸，垫在下面，这样，加过标本的小孔看过去下面的字会变小，没加的字正常，非常容易区分。

　　● 可以利用液面反光与没有加的孔加以区别。

　　ELISA 本生一直视质量控制为企业的生命，追求企业竞争力的不断提升。公司在经营中始终秉承：遵纪守法，严于律己，宽仁以待，敢于承担的企业精神作为标准，以过硬的质量和优良的服务来维护和拓展市场，较大限度的满足客户的需求。与客户的共赢，是我们的发展目标。本生!您信任的合作伙伴。我们愿与您真诚合作，共创美好的未来。