使用UHPLC-SEC色谱柱优化尿激酶分析方法

尿激酶是从新鲜人尿中提取的，或从人肾组织培养中获得的一种酶蛋白，是临床上一种常用的溶解血栓的药物。它由高分子量尿激酶 (Mw=54000) 和低分子量尿激酶 (Mw=33000) 组成的混合物。

为使尿激酶达到ZJ分离效果，本应用使用粒径2 µm的TSKgel UP-SW2000超GX液相尺寸排阻色谱柱与G2000SWXL色谱柱，对尿激酶进行了对比分析。

溶液的配制

色谱流动相配制：0.2 mol/L磷酸二氢钠水溶液，用磷酸调pH至3.0 。

样品：尿激酶测试方法优化溶液浓度：2.5 mg/mL

分析条件

仪器：Thermo Ultimate3000

色谱柱1：TSKgel UP-SW2000 (2µm, 4.6 mmI.D.×30cm)

色谱柱2：TSKgel G2000SWXL (5µm, 7.8 mmI.D.×30cm)

流速：0.18 mL/min for UP-SW2000、0.5 mL/min for G2000SWXL

柱温：25℃

样品盘温度：10℃

进样量：10 µL

检测器：紫外检测器@280nm

分析结果

图1.  UP-SW2000色谱柱分离谱图

图2.  G2000SWXL色谱柱分离谱图

结果与讨论：

相较于G2000SWXL色谱柱，TSKgel UP-SW2000对多聚体、高分子量尿激酶、低分子量尿激酶的分离度均有所提高。

同时对比了等量溶质不同进样体积，高浓度样品小进样量，分离度较好一些。UP-SW2000色谱柱可满足药典要求：高分子量尿激酶峰面积占90%以上，且与低分子量尿激酶分离度大于1.0。

ACE® UHPLC 可重复使用的色谱柱连接器

• 压力额定值> 1700bar（> 25000psi）

• 与所有UHPLC系统兼容

• 与所有UHPLC色谱柱品牌兼容

• 消除连接不良

• 创新且可重复使用的设计

所有UHPLC色谱柱品牌都需要正确安装，以实现Z大柱效。

为了避免出现问题，不推荐使用型压制接头，因为这些接头在安装时不允许在管道、接头与色谱柱入口之间自由移动。

这可能会导致色谱柱连接不良，进而由于向系统引入了额外的柱体积（死体积）表现出非预期的峰拖尾。

或者，可以观察到入口接头连接处有泄漏。
ACE UHPLC色谱柱连接器（p/n EXL-CC）可重复使用，每次均可以使UHPLC色谱柱得到正确安装。

它们独特的设计确保它们可以随着重复使用保持压力等级，但无需性地焊在入口管道上。

为了使接头的使用寿命尽可能Z大，需要使用ACE扭矩扳手（p/n EXL-TW）。
标准ACE HPLC PEEK手指连接器（p/n ACE-FT，压力额定值为350bar / 5000psi）可用在UHPLC色谱柱出口端处，该处压力要求较低，但正确的连接仍然很重要。

前言

聚合酶链式反应（PCR）是用于扩增特定DNA片段的分子生物学实验技术。实时荧光定量PCR（以下简称qPCR）作为第二代PCR技术，自1996年推出以来，已经广泛应用于基因表达分析、病原微生物检测、动植物育种等许多研究领域，为了获得最理想的检测结果，qPCR从样本采集、核酸提取、cDNA合成到上机检测的流程有许多可以优化的参数。

qPCR实验的工作流程首先需要确定研究的目的，根据实验设计规划好实验分组、重复次数等细节。接下来分为样本准备和引物探针验证两个重要的步骤。样本准备主要是核酸提取逆转录等步骤，引物探针需要去测试特异性和效率。接下来需要使用qPCR仪来对样品中的目的核酸进行扩增qPCR结束后根据实验目的对目的核酸进行相对或者绝对定量。接下来讲的qPCR体系优化会围绕着这个流程展开。

1.样本的采集与处理

首先，提前做好功课，了解样本的不同分型，或者了解详细的细胞分群。如果条件允许尽可能覆盖所有的组织类型或者细胞类型。其次，尽可能增加样本数量，也就是生物学重复，从而更客观地反映生物变异程度。另外，qPCR实验也需要有技术重复来降低误差。

采样是需要严格规划的过程，比如材料的时效性、珍贵程度等，都要纳入考量范围。样品要尽量新鲜，取样尽可能快速。戴手套操作，防止污染。如果不马上提取核酸，需要-80°C保存，并尽快处理。

2.核酸的提取和检测

模板的质量直接影响到检测性能。核酸提取需要有效地将RNA或DNA从其他混合物中分离。RNA样本中的污染物——基因组DNA、DNA结合蛋白、酚类化合物或在提取RNA过程中引入的外源杂质(如手套中的粉末)——都已被证明会抑制下游实验，如逆转录和PCR扩增。核酸提取需要使用无菌无酶的试剂耗材，避免RNase或DNase污染，并对内源RNAse或DNAse进行有效抑制；多糖多酚样品要考虑多糖多酚杂质的有效去除。低温保存防止RNA或DNA降解。

降解或不纯的RNA会限制逆转录反应的效率，降低产量。部分降解的RNA可能不能给出准确的基因表达结果。对于基因的定量，必须使用高质量的RNA，这意味着需要非常仔细地检查RNA的浓度和质量。可采用高分辨率琼脂糖凝胶检测核酸质量和分光光度法（A260/A280=1.8和A260/A230=2.0）检测核酸纯度和浓度。

3.cDNA合成

RNA 质量对 cDNA 合成结果会产生重要影响。并且RNA 很脆弱，容易降解。为了保证 RNA 的完整性，我们需要非常注意，比如在冰上操作，用 RNase-free 的枪头和离心管，减少操作时间等。在反应体系中加入 RNase 抑制剂也能有效防止 RNA 降解。

如何评价样品中的杂质对逆转录的影响呢？可以梯度稀释后绘制标准曲线，如果低浓度的样品点数值偏大比较明显，基本可以判定杂质影响显著。

不同厂家的反转录试剂会有差异，对RNA中的杂质耐受程度也不同。逆转录酶在整个反转录体系中具有关键性影响。除了活性以外，逆转录酶的热稳定性同样很重要，在较高温度下进行逆转录，能够减少 RNA 的二级结构，增加逆转录的效率。

除了掌握 RNA 的完整性之外，反转录之前还需要对 RNA 浓度进行测定。一般反转录试剂盒会对上样量有要求，建议 total RNA 上样量小于 5 μg。超过这个范围，会使反转录产物产生偏好性 (表达丰度高的基因优先被反转录) 而造成定量结果不准确。

逆转录出来的cDNA可以直接放在4°C保存，若长期不用，可分装，然后-20°C保存。

4.qPCR方法的建立

① 定量方法

绝对定量：检测起始模板数的精确拷贝数，需要标准品构建标准曲线。

标准品可以是纯化的基因组DNA、质粒DNA或者体外转录RNA(cDNA)，其作用是生成标准曲线，建立Ct值与浓度之间的线性关系。

标准品与待测样品的PCR效率一致，且接近100%，与样品的性质尽可能接近，与样品相同的扩增条件（PCR体系、耗材、同一次扩增），大于或等于5个梯度稀释的标准品。

相对定量：在一个样本中，目的基因相对于内参基因的量的变化。

内参基因选择建议筛选不少于三个内参基因来归一化RT-qPCR数据。目的是消除外部样品偏差，例如总RNA含量，RNA稳定性，酶效率或样品装载量的变化。

对候选的内参基因进行qPCR 实验，得出Ct平均值以及 Ct值的标准偏差，选择SD最小的基因作为实验内参。可通过geNorm 、 BestKeeper  、 NormFinder、RefGenes 等工具来评估您的内参基因。

② 荧光标记方法

染料法：利用能与DNA双链结合的染料来实现，如SYBR Green I。该染料在游离状态下呈现微弱的荧光，一旦与双链DNA的双螺旋小沟结合，其绿色荧光增强约1000倍。因此其总的荧光强度与双链DNA含量成正比，利用这一关系可以反映生成的PCR产物的量。

TaqMan荧光探针：是一种寡核苷酸探针，荧光基团连接在探针的5'末端，而淬灭剂则在3'末端。PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收; PCR扩增时, Tag酶的5'-3'外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成,实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。常用的荧光基团是FAM，TET，VIC，HEX。

引物探针设计可以参考Gene π网站.

③  引物扩增效率验证

标准曲线是评估PCR扩增效率最可靠和稳定的一种方法，该方法涉及到制作一系列的样品来控制目标模板的相对数量。最常用的是10倍梯度稀释样品，采用标准qPCR程序进行扩增获得Cq值，最后根据各样品浓度及相应的Cq值绘制标准曲线，得到线性方程Cq= -klgX0+b，扩增效率E=10(-1/k)-1。利用qPCR进行定量分析时，要求扩增效率范围在90%-110%（3.6＞k＞3.1）。

④  反应体系优化

▶  根据仪器类型，选择合适的耗材和qPCR试剂。

▶ 每对引物先进行预实验，确定特异性以及最适浓度。

▶  配置不同的PCR反应体系，选择每个组分合适的浓度。

▶  设置温度梯度测试引物最合适的退火温度。

▶  实验设置NTC、NRT、 NEG和POS等对照组，来监控实验体系或污染。

实时荧光定量PCR常见问题分析

1.可疑的扩增曲线

真正的扩增曲线，有特征的形状：首先背景信号，然后是三个增长阶段（指数增长期、线性增长期和平台期）。

如果不是同时具有特征性的三个增长阶段，没有典型的指数增长期，那就不存在扩增。

平台期很低也是常见的异常扩增曲线。可能是模板的浓度太低。通常如果模板的起始浓度太低, 反应体系中会形成大量的引物二聚体。大量引物二聚体的形成使得引物很快消耗完，从而造成扩增曲线的平台期很低。这种情况可通过调整引物和模板的比例。

2.异常的荧光信号

NTC出现荧光信号---引物二聚体形成或气溶胶污染，查看熔解曲线是否为单一峰。

3.扩增效率过高或过低

过低的扩增效率（<90％）可能存在的原因：

▶  移液器校准不良或移液技术差。

▶ 不正确的稀释导致标准曲线出现错误。

▶  引物设计不好或扩增子具有二级结构。

▶  标准曲线动态范围太小。

▶  Taq酶无活性或活性降低。

▶  样品抑制。

过高的扩增效率（> 110％）可能存在的原因：

▶  移液器校准不良或移液技术差。

▶ 不正确的稀释导致标准曲线出现错误。

▶  引物二聚体或非特异性扩增。

▶  标准曲线动态范围太小。

▶  基因组DNA污染。

4.重复性差

为精确定量，对每个样品都要做重复实验，复孔之间的Ct值不应超过0.5，标准偏差不大于0.2，这样，实验结果就有很好的精确度。

造成重复性差的原因：

▶  加样误差（操作或者加样器导致）。

▶ 没有将试剂和样品充分混匀。

▶  低拷贝的目的片段→泊松分布。

▶  基线阈值设定不合理。

Cielo™实时荧光定量PCR系统

Harness of the power of qPCR

☑   数据可靠性：连续1000次实验后，结果高度一致。

☑  应用灵活性：提供多种qPCR应用分析。

☑   流程智能化：中英文用户界面，触控操作，可多机联用。

☑   在线便捷性：主机可独立运行qPCR程序，数据可USB、Wi-Fi等网络传输。

氨基酸作为构成多肽和蛋白的基本单元，是非常重要的一类化合物。
随着生物药的逐渐兴起，作为原料的氨基酸的质量分析的需求也越来越大。
大部分氨基酸由于至少同时含有大极性的氨基和羧基，因此整体极性很大，常用的C18柱+反相流动相对其保留很弱，同时部分氨基酸由于紫外吸收很弱，因此让流动相和检测器的选择更有挑战。

本文系统总结广州菲罗门积累经典色谱应用，包括氨基酸衍生化分析、非衍生氨基酸直接分析、保护型氨基酸的手性分析以及非保护型氨基酸直接手性分析四种广受关注的应用。

一、氨基酸衍生化分析
氨基酸衍生的方法比较多，最常用的是AQC衍生和PITC衍生。
虽然过程相对繁琐，但是通过衍生后，一举解决了氨基酸分析的两个难点：
保留和紫外吸收。
通过衍生反应在氨基酸上接上疏水且有紫外吸收的基团，可以实现在C18柱+反相流动相的体系下进行HPLC分析。

AQC衍生法：

 PITC衍生法：

二、非衍生氨基酸直接分析

当选择氨基酸非衍生直接分析时，对于有些疏水性比较好的氨基酸，可以直接用C18类柱子分析，比如：

可以选用带有HILIC作用的色谱柱实现保留，当使用磷酸盐类时，可以在截止波长条件下用UV检测，比较经典的应用是用ACE HILIC-B检测门鸟氨酸：

菲罗门也推出Comix系列智能神柱，可以在以ELSD、 CAD或者MS为检测器的条件下分析氨基酸。

三、保护型氨基酸手性分析

当氨基酸上的氨基和羧基用Boc和/或FMOC等保护起来时，可以用正相或者反相的多糖类手性柱实现非常好的分离，有现成的分析方法，可以极大地减少方法开发的时间。

四、非保护氨基酸直接手性分析

对于非保护的氨基酸，菲罗门推出AAOA分析柱，即通过键合D-青霉胺于十八烷基柱上而成的配体交换型手性柱。该手性柱手性柱可以用于拆分α-型有机酸、α-型非衍生氨基酸及其衍生物、二元胺、二肽、内酰胺和氨基醇等。

到目前为止，我们已经实现了有机酸如D, L-乳酸、D, L-酒石酸的拆分，也实现了氨基酸如D, L-丙氨酸，D, L-天门冬氨酸，D, L-缬氨酸，D, L-脯氨酸：

总结: 本文全面总结了氨基酸类的HPLC分析方法，包括氨基酸衍生化分析、非衍生氨基酸直接分析、保护型氨基酸的手性分析以及非保护型氨基酸直接手性分析。

对于具体氨基酸的分析如有疑问，可以电话020-22826668找到您专属的技术工程师。

氨基酸作为构成多肽和蛋白的基本单元，是非常重要的一类化合物。

随着生物药的逐渐兴起，作为原料的氨基酸的质量分析的需求也越来越大。
大部分氨基酸由于至少同时含有大极性的氨基和羧基，因此整体极性很大，常用的C18柱+反相流动相对其保留很弱，同时部分氨基酸由于紫外吸收很弱，因此让流动相和检测器的选择更有挑战。

本文系统总结广州菲罗门积累经典色谱应用，包括氨基酸衍生化分析、非衍生氨基酸直接分析、保护型氨基酸的手性分析以及非保护型氨基酸直接手性分析四种广受关注的应用。

一、氨基酸衍生化分析
氨基酸衍生的方法比较多，最常用的是AQC衍生和PITC衍生。
虽然过程相对繁琐，但是通过衍生后，一举解决了氨基酸分析的两个难点：
保留和紫外吸收。
通过衍生反应在氨基酸上接上疏水且有紫外吸收的基团，可以实现在C18柱+反相流动相的体系下进行HPLC分析。

AQC衍生法：

 PITC衍生法：

二、非衍生氨基酸直接分析

当选择氨基酸非衍生直接分析时，对于有些疏水性比较好的氨基酸，可以直接用C18类柱子分析，比如：

可以选用带有HILIC作用的色谱柱实现保留，当使用磷酸盐类时，可以在截止波长条件下用UV检测，比较经典的应用是用ACE HILIC-B检测门鸟氨酸：

菲罗门也推出Comix系列智能神柱，可以在以ELSD、 CAD或者MS为检测器的条件下分析氨基酸。

三、保护型氨基酸手性分析

当氨基酸上的氨基和羧基用Boc和/或FMOC等保护起来时，可以用正相或者反相的多糖类手性柱实现非常好的分离，有现成的分析方法，可以极大地减少方法开发的时间。

四、非保护氨基酸直接手性分析

对于非保护的氨基酸，菲罗门推出AAOA分析柱，即通过键合D-青霉胺于十八烷基柱上而成的配体交换型手性柱。该手性柱手性柱可以用于拆分α-型有机酸、α-型非衍生氨基酸及其衍生物、二元胺、二肽、内酰胺和氨基醇等。

到目前为止，我们已经实现了有机酸如D, L-乳酸、D, L-酒石酸的拆分，也实现了氨基酸如D, L-丙氨酸，D, L-天门冬氨酸，D, L-缬氨酸，D, L-脯氨酸：

总结: 本文全面总结了氨基酸类的HPLC分析方法，包括氨基酸衍生化分析、非衍生氨基酸直接分析、保护型氨基酸的手性分析以及非保护型氨基酸直接手性分析。

对于具体氨基酸的分析如有疑问，可以电话020-22826668找到您专属的技术工程师。