平时HPLC一般用的柱子是反向色谱柱吗？

        大家都知道HPLC色谱柱的寿命是有限的，在使用过程中随着时间的推移，其性能开始下降。你可以通过峰形和峰形之间的分离，柱背压的不规律增加以及重影峰的出现来判断HPLC色谱柱的性能出现了下降。色谱柱是昂贵的色谱耗材，平常使用完毕后需要保养。如果色谱柱真的发生了性能下降，有什么方法可以恢复呢?

        首先，如果色谱柱由于过载或使用不兼容的流动相而结垢，是可以恢复的，但已经损坏的色谱柱或已经过使用寿命的色谱柱无法恢复，需要更换。

        色谱柱还原程序如下，供大家参考：

        反相柱

        反相分离是大多数HPLC分离中使用的主要操作模式。填料主要由C18，C4，CN，NH2和苯基固定相组成。建议以水-乙腈-异丙醇-庚烷-异丙醇-乙腈-流动相的顺序用10至20倍体积的溶剂洗脱

        正相柱（氨基，二醇，硝基，氨基固定相）

        用20倍体积的溶剂冲洗，按照庚烷-异丙醇-乙腈-

       水-异丙醇-庚烷的顺序。

        GPC / GFC色谱柱

        用5倍体 积且PH值为3的0.1%磷酸盐缓冲液冲洗。如果使用了保留力强的蛋白质，则使用从水到乙腈再到水的60分钟梯度液冲洗。

        色谱柱在使用前都要对其性能进行考察，使用期间或放置一段时间后也要重新检查，并将结果保存起来，作为今后评价柱性能变化的参考。柱性能指标包括在一定实验条件下（样品、流动相、流速、温度）下的柱压、理论塔板高度和塔板数、对称因子、容量因子和选择性因子的重复性，或分离度。进行柱效比较时，还要注意柱外效应是否有变化。但要注意：柱性能可能由于所使用的样品、流动相、柱温等条件的差异而有所不同；另外，在做柱性能测试时是按照色谱柱出厂报告中的条件进行（出厂测试所使用的条件是zui佳条件），只有这样，测得的结果才有可比性。

        恒谱生色谱柱柱管由不锈钢制成，不锈钢柱内壁多经过抛光，减小管壁效应，提高柱效，柱中填充键合硅胶或聚合物填料。色谱柱基于高纯硅胶，采用独特键合技术，具有优异的峰形，灵敏性好。基质金属含量低，对所有类型的分析物均表现完好峰形。机械强度高，稳定性好，质控严格，确保色谱柱性能和色谱柱的使用寿命。有多种尺寸规格可供选择以适应色谱工作者及其使用的不同需求。我们有专业的技术工程师团队为您的需求提供解决方案，欢迎前来咨询了解！

        误区1：HPLC 柱不可以反冲

        这是不正确的。通常情况下液相色谱柱所设计的耐压值是远高于最da操作压力的。换柱时反冲可以清洗柱头一些具有强吸附性质的物质，我们冲洗出这些残留物质也是为了防止压力增大。但是如果你购买的色谱柱在柱头使用了大粒度的填料，这时你反冲会冲出这一部分填料。因此你要先检查一下自己使用的液相色谱柱再选择是否反冲。

        误区2：所有的C18（L1）色谱柱都是一样的

        这是不正确的。在早期的HPLC体系中，C18是唯yi反向色谱的键合固定相，因此C18就作为了反向色谱柱的标准。但是时代不会一直停滞脚步，人们对于科学的追求与理解愈发深刻，更多的固定相出现了，诞生了许多C18色谱柱。虽然同样是选用硅胶作为基体，但各自都有自己特定的填料键合合成工艺，因此色谱性能也不相同。所以单纯的因为名称都是C18色谱柱，想当然觉得性能都一样是不对的。

        误区3：色谱柱里一旦进入空气就会损坏

        我们都知道当色谱柱不与色谱仪连接的时候，需确保色谱柱被紧紧地密封。但是在实际应用中，即使色谱柱的端部进入了少量的空气也不是很严重的事情。当色谱柱连接到色谱仪上使用时，在系统初始加压阶段，在很短的时间内空气就会被溶剂挤压排出。所以，不要因为色谱柱进入了少量空气就认为色谱柱已被损坏。

        误区4：保护柱是没必要的

        这也是太JD的误区，其实使用保护柱有很多好处。HPLC的移动相中常使用各种试剂，其中会混有一些不溶解物质或不纯物质。多数不溶物通过使用筛板或膜滤器过滤移动相可以除去，但极细小的粒子还是无法完全过滤。此外在移动相调制之后，还有通过空气、容器、人体等有不溶物、不纯物落入的可能性。这些不溶物、不纯物质会污染柱、或使堵塞、或给分析带来不良影响等。这时通过在色谱柱前安装分析保护柱可以防止其产生，能起保护色谱柱的作用。相较于更换一根昂贵的分析柱，添加或更换保护柱只需要很少的花费。恒谱生液相色谱保护柱几乎无死体积、便于更换，适用于UHPLC系统的高压，将那些强保留的、不可吸附的化合物截留下来。样品和流动相的过滤可以维护保护柱对化学污染物的吸附容量，能够更长时间的维护柱效，延长色谱柱的使用寿命。

        误区5：反相色谱柱不可以使用纯水相

        这也是不正确的，有些色谱工作者在使用低有机溶剂含量或者纯水作为反相色谱柱的流动相时，发生相塌陷的现象，所以有些人认为反相色谱柱不可以使用纯水相。但事实上市场上销售的反相色谱柱（如极性嵌入和极性封端柱）都是具有水浸润性的，其表面特性是允许使用纯水的，不会导致塌陷或者保留时间移位。

        误区6：色谱柱填料粒径越小、压力越高，分离效果越好

　　色谱柱性能的好坏不能单纯用填料是否是超小的粒径以及超高的柱压来评估。现代对于色谱柱的柱特性研究越来越深入，已经研发了一些能够提高色谱柱柱效的方法。例如，采用新的表面多孔材料的色谱柱，其柱效与sub-2µm UHPLC柱效一样好，与常规的LC填料色谱柱比起来，柱压很低。

　　误区7：柱压不会影响色谱分离效果

        近年来，柱压的问题引起了很多色谱工作者的注意，柱压是色谱的很多参数都是受柱压影响的，包括部分溶质的摩尔体积、停滞体积、柱孔隙度、保留因子、流动相密度、介电常数、固定相结构、pH值和电离常数等。当色谱柱在约2000psi（13.789MPa）压力下运行时，即使保留时间上存在小差异，也并不会引起我们的注意；特别是如果重复性较好及定量不受影响的时候。但是，当柱压接近2000psi（13.789MPa）时，柱压的影响可能就相当明显了。

        近几十年来，液相色谱法被广泛应用于生命科学领域，药物分析，食品分析，环境监测等领域，人们对于液相色谱法的不断研究，也诞生出更多的液相色谱应用以及解决方法等，相信未来液相色谱法的应用领域会更加广阔。

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使用Advanced Chromatography Technologies的品质柱前过滤器可以保护您的HPLC和UHPLC色谱柱免于过早失效。
HPLC色谱柱失效的Z常见原因之一是色谱柱入口筛板上聚集的颗粒物质，导致背压较高和/或峰形变形。

据估计，超过70％的HPLC色谱柱失效是由入口筛板堵塞引起的。UHPLC色谱柱（特别是那些用2µm以下颗粒填充的色谱柱）特别容易受入口筛板堵塞的影响。
Advanced Chromatography Technologies可以提供三种不同的柱前过滤器，每种过滤器均为色谱柱的特殊保护而设计。

保护您的HPLC和UHPLC色谱柱免于过早失效

1.利用ACE键合相的固定相选择

分离度方程式可以确定影响分离度的参数：柱效（N）、容量因子（k）和选择性（α）。

在过去几年里，柱效和使用超GX色谱柱（被称为“UHPLC”色谱柱）作为实现分离目标的手段已得到了极大的重视。

UHPLC已通过更快速的分离和更快速的方法开发提高实验室生产力来证明了其价值。

然而，选择性往往被忽视，且其重要性也被强调柱效所掩盖。这是令人遗憾的。

在影响分离度的三个参数中，选择性是Z为重要的。

（参见图1）通过利用柱效和选择性，通常可以实现更好和更快的分离。

图 1：N、α和k对分离度（Rs）的影响

提高N，α或k可以提高分离度（Rs）。

然而，从这些图中可以看出，随着N或k值的提高，对分离度的改善效果也逐渐降低。

另一方面，提高选择性（α）则没有这个问题，因此其成为开发分离方法时的Z佳优化变量。

在反相色谱中，固定相与分析物之间存在多种相互作用的机制，这可以用来实现分离。

这些相互作用机制包括：疏水性结合、π-π、氢键、偶极-偶极和形状选择性。

不同类型的键合相将提供其中一种或多种相互作用机制。表1列出了ACE键合相和每种可能的主要相互作用机制，这取决于分析物和流动相条件。

表1: 比较不同键合相的分离机制/相互作用                                                                                  

利用键合相的选择性实现更好的分离。
图2表明了两种ACE键合相即C18-AR与苯基之间的选择性差异。
尽管两种键合相提供了强π-π和偶极-偶极相互作用的可能性，但是在其它可能的相互作用机制（特别是疏水性结合）的强度方面，它们存在显著差异。

C18-AR可能具有其它不同的分离机制，可以为复杂的混合物带来更好的分离效果。对于其他混合物，可能不是这种情况，这是ACE键合相的优势。

当开发分离方法时，ACE键合相可以提供各种可供选择的重要保留机制。

非常强大且独特的C18-AR和C18-PFP相只有在ACE和ACE Excel色谱柱中可以获得。
通过利用柱效和选择性，可以实现更好的分离。

图 2：C18-AR与苯基相之间选择性差异的比较

色谱柱尺寸： 50 x 2.1 mm, 3 μm
流动相：

A= 20mM KH2PO4,pH 2.7（溶于水中）；
B= 20mM KH2PO4,pH 2.7（溶于甲醇/水中：65:35, v/v）
流速： 0.6 mL/min
温度： 60 ℃
检测： UV 214 nm
梯度： 5分钟内从3至B，并持续1分钟。

样品：
1. 甲硝唑
2. 3-羟基苯甲酸
3. 苯酚
4. 苯甲醇
5. 咖啡茵
6. 水杨酸
7. 喹喔啉
8. 苯甲酸
9. 奎宁
10. 非那西丁
11. 1,4-二硝基苯
12. 1,3,5-三硝基苯
13. 呋塞米
14. 1,3,5 -三甲氧基苯
15. 吡罗昔康
16. 卡维地洛
17. 苯甲酸乙酯
18. 去甲替林

C18-AR相的疏水性更大，这可以为色谱峰对（13,14）和（15,17）提供更多的保留值和更佳的选择性。还要注意C18-AR与苯基相的洗脱顺序有很多变化。

图3给出了键合相选择能力的另一实例。

一个分离是用C18键合相的UHPLC色谱柱完成，另一个分离是用C18-PFP键合相的UHPLC色谱柱完成。

C18-PFP键合相提供的额外分离机制，使得总体分离效果更佳出色。

图 3：ACE Excel可以获得zhuo越的分离度和峰形：药物及其相关物质的UHPLC结果

条件
色谱柱尺寸：50 x 2.1mm
流动相：

A = 5mM甲酸（溶于水中）
B = 5mM甲酸（溶于甲醇中）
梯度：5分钟内从3至B
流速：0.6 mL/min
温度：40 ℃
检测：UV 254 nm

样品
1. 对乙酰氨基酚
2. 氢氯噻嗪
3. 甲基苯基亚砜
4. 甲基苯砜

在C18 UHPLC色谱柱和C18-PFP色谱柱上同样快速地产生色谱图。

然而，C18-PFP色谱柱可以为色谱峰对（13,14）和（15,17）提供更佳的选择性，因此能够提供优越的总体分离性能。

2.ACE和ACE Excel硅胶基质固定相几乎消除了硅醇基对色谱分离的不利影响，并且在为碱性化合物提供zhuo越峰形方面赢得了口碑。  

峰拖尾可以降低分离度，降低灵敏度，甚至干扰准确度和精密度（图4）。  

峰拖尾有许多潜在的原因，但分离碱性物质时的主要原因是硅胶固定相载体颗粒表面上的酸性硅醇基与分析物上的氨基之间的相互作用（图5）。  

图 4：峰拖尾对分离度和灵敏度的影响  

随着峰拖尾（Tf，拖尾因子）从1.0增加到2.0，分离度（Rs）从1.5下降到0.87。  

由于峰宽增加以及峰面积保持不变，灵敏度（峰高）也随着峰拖尾的增加而下降。  

ACE色谱柱采用具有极低硅醇活性的超惰性硅胶制成。  

这种超纯硅胶采用ZL技术进行有效键合和彻底封尾。  

导致这种硅胶基质的固定相几乎消除了硅醇基对色谱分离的不利影响。  

ACE色谱柱的超惰性特性使其成为分离极性碱性化合物的理想选择。  

当分离复杂碱性化合物时,与其他现代碱性去活色谱柱相比，ACE色谱柱总是能给出明显更好的峰形和柱效（图6）。  

图 5：峰拖尾相互作用  

硅胶固定相载体表面上的酸性硅醇基可形成与碱性化合物相互作用的离子交换位点。  

这种离子交换的相互作用通常可以导致峰保留（二次保留），并当采用反相HPLC分离胺类化合物时引起峰拖尾。  

一种几乎消除了硅醇基对色谱分离不利影响的硅胶基质固定相  

图 6：峰拖尾比较  

条件
色谱柱尺寸：50 x 2.1 mm
流动相：40％甲醇，60％水
流速：0.2 mL/min
温度：22ºC
样品：吡啶  

报告了碱性化合物（吡啶）在各种常见C18色谱柱上的塔板数。  

在10％峰高下测量塔板数，以使峰拖尾纳入在测量中。  

ACE C18-PFP由于其超惰性性质而达到了Z高塔板数。  

3.ACE Excel为UHPLC带来了享有盛誉的ACE HPLC性能  

重要的是要认识到色谱柱的选择性和柱效是独立的变量，在开发分离方法时您不必选择使用一种而不使用另一种。事实上，为了实现Z佳的总体分离效果，您应当对上述两个变量以及保留值进
行优化。当需要实现高速分离时尤其如此。（参见图7）  

图 7：利用柱效和键合相选择性来开发更快的分离方法  

条件：
流动相：  

A = 5mM甲酸（0.189）ml / L;
A = 5mM甲酸（溶于甲醇中）
柱温：40℃
检测：PDA, 254nm  

样品：
1. 阿司匹林
2. 非那西丁
3. 1,3-二硝基苯
4. 苯甲酸乙酯  

5. 尼美舒利
6. 布洛芬
7. 吲哚美辛

利用UHPLC色谱柱更高的柱效，可在更高的流动相流速下使用更短的色谱柱，以使这种混合物的分离时间缩短80%（相比HPLC色谱柱）。
然而，也可以通过优化键合相的选择性来进一步缩短分离时间，在这个案例中，就是利用了C18-PFP键合相所具有的增强的选择性。

与C18UHPLC色谱柱、C18 HPLC色谱柱相比，ACE Excel C18-PFP UHPLC色谱柱分别将混合物的分离时间缩短了80％以上以及96％，同时保持了所有峰的分离度。

ACE Excel UHPLC色谱柱的设计旨在充分利用低扩散、超高压UPLC®和UHPLC仪器（高达1000 bar），并可与所有市售UPLC和UHPLC系统相兼容。
ACE Excel UHPLC色谱柱可以为碱性化合物提供更佳的峰形，改善柱子与柱子之间的重现性，提供额外的利用多种分离机制的固定相，以及改善色谱柱的耐用性。

ACE Excel UHPLC色谱柱的可用性意味着色谱分析师在使用UPLC和UHPLC仪器时有更多的选择来获得更好的结果。

图 8：ACE Excel色谱柱提供快速、高分辨率的分离

条件
色谱柱：ACE Excel C18, 2 μm, 3.0 x 50 mm
流动相：60秒内从30%B至B
A =水+ 0.1％TFA B =乙腈
流速：2.5 mL/min
柱温：40ºC
压力：703 bar (10,335 psi)
检测：PDA, 254 nm
仪器：安捷伦1290 UHPLC
化合物
1. 乙酰苯胺
2. 苯乙酮
3. 苯丙酮
4. 苯丁酮
5. 二苯甲酮
6. 苯戊酮
7. 苯己酮
8. 苯庚酮
9. 苯辛酮

ACE Excel C18色谱柱可在不到60秒内提供这9种分析物的基线分离。

4.已经证实ACE HPLC色谱柱和ACE Excel UHPLC色谱柱具有持久耐用的、可靠的日常性能和zhuo越的色谱柱寿命。  

通过键合在硅胶固定相载体上的硅氧烷的酸化水解可以失去键合相，从而降低色谱柱的寿命。该酸水解随着流动相pH的降低和柱温的升高而增加。  

与C18相相比，较短的烷基相如C4和C3以及苯基相通常更容易失去键合相。此外，低纯度的硅胶固定相载体和低表面覆盖的固定相载体使得一些键合相更易于酸解。
由于使用超高纯度的硅胶固定载体粒子以及键合相的极高表面覆盖，ACE键合相表现出极高的稳定性。（参见图9）
尽管所有ACE键合相的稳定性都很优异，但是一些键合相并不像其它键合相那样稳定。例如，通常认为C18键合比柱长较短的烷基相、PFP相和苯基键合相更稳定。  

实际上，典型的苯基固定相稳定性不佳是该相在方法开发中不常被选择的主要原因之一。
为了解决这个问题而开发了ACE C18-AR，其允许色谱分析利用强大的π-π和偶极-偶极分离机制，并仍然享有C18相的坚固性及耐用性。  

如图10所示，ACE C18-AR不仅对典型的苯基键合相具有非常优异的稳定性，它甚至还比许多其他C18键合相表现出更佳的稳定性。  

类似地，ACE C18-PFP提供了多种分离机制，可以利用它们实现更佳的总体分离效果，同时从C18相的稳定性中受益。  

图 9：酸稳定性，pH 1.8  

条件
色谱柱：ACE 4.6 x 150 mm
流动相：50% CH3CN, 50%水
流速：1.0 mL/min
温度：22 °C
分析物：菲  

酸性暴露条件：
流动相：50% CH3CN 50% 0.1%TFA（溶于水中）（pH 1.8）
流速：1.0 mL/min
温度：22 ℃  

图10：加速柱稳定性研究：pH 1.9时80℃  

酸性暴露条件：
流动相：5:95 MeOH/0.1% TFA（溶于水中）（pH 1.9）
流速：0.20 mL/min
温度：80 ℃
色谱柱尺寸：50 x 2.1mm
分析物：菲  

使用设计用于加速柱降解下的条件，ACE C18-AR相显示保留损失极少，其寿命相当于高度稳定的ACE C18相。两种固定相均由相同的超纯硅胶而制成，而且比Zorbax SB-C18的耐久性更好(Zorbax SB-C18曾视作在高温和低pH条件下具有极好稳定性的固定相）。
正如预期的那样，基于低纯度硅胶（Waters Spherisorb ODS2）的C18键合柱在这些加速条件下寿命大大降低。
特别值得注意的是常规苯基色谱柱与ACE C18-AR的寿命比较结果。与ACE C18-AR相比，尽管使用高纯度二氧化硅，苯基色谱柱的寿命仍降低，这表明ACE C18-AR可能适用于那些使用苯丙基色谱柱寿命短的应用。  

将HPLC和UHPLC连接到通常被称为LC-MS的质谱仪上已经相当普遍。  

然而，质谱对可能从HPLC/UHPLC色谱柱上洗脱下来的微量的键合相（称为柱“流失”）非常敏感。柱  

流失可能会干扰分析结果，并且重要的是，LC-MS应用中所选择的色谱柱具有足够稳定的键合相以避免过量的柱流失。  

图11表明ACE C18-PFP色谱柱几乎没有“流失”干扰LC-MS分析。  

C18-PFP（以及ACE C18和ACEC18-AR）的稳定性使得这些色谱柱更适合LC-MS应用。  

图 11：ACE C18-PFP色谱柱的低柱流失使其成为LC/MS应用中的理想选择  

条件
色谱柱尺寸：50 x 3.0 mm
流动相：梯度：在5分钟内从5至95% B，95% B时持续5分钟
A: 0.1％甲酸(溶于水中)
B: 0.1％甲酸(溶于乙腈中)
流速：0.43 mL/min
温度：60ºC
检测：安捷伦1100 MSD ESI正离子快速扫描模式,快速扫描全50 – 1000 m/z
样品：空白运行  

柱流失可能会干扰LC-MS应用中目标分析物的检测和测量。  

ACE C18-PFP色谱柱未显示柱流失。  

所有ACE色谱柱的低流失特性使其非常适合LC-MS应用。  

UHPLC色谱柱可能缺乏耐用性。加上入口筛板堵塞的可能性，您可能面临色谱柱的耐用性不如HPLC色谱柱的问题。  

ACE Excel色谱柱非常宽容，并提供您期望从HPLC色谱柱中获得的相同耐用性和使用寿命。  

ACE Excel将改变您对UHPLC色谱柱耐用性的看法。  

ACE Excel色谱柱不仅填装的更好，还采用了ZL的入口筛板设计，使其比其它UHPLC色谱柱更不容易被堵塞。  

仍建议您像使用任何UHPLC色谱柱一样过滤样品和流动相，但ACE Excel色谱柱比其他UHPLC色谱柱更为宽容，并提供与HPLC色谱柱相同的耐用性和使用寿命。  

图 12：ACE Excel色谱柱在耐用性方面有良好的口碑  

将2.1×100mm ACE Excel C18 UHPLC色谱柱在平均1,000 bar（14,500 psi）压力下进行2000多个梯度的运行。  

在该稳定性研究结束时，柱效（塔板数）和保留时间基本保持不变。  

5.ACE Excel色谱柱具有口碑zhuo越的可重现性。  

柱子与柱子之间的可重现性受硅胶固定相载体的生成、固定相与固定相载体的键合以及色谱柱中固定相的填充的影响。  

在色谱柱的制备过程中，每个阶段被控制得越好，色谱柱的可重现性和质量则越好。
ACE色谱柱在色谱柱制备过程中的每个阶段均得到了全面控制。  

这些控制措施确保ACE色谱柱在柱间以及批次之间产生可靠且可预测的性能。  

图13提供了典型批次验证测试的实例。  

硅醇活性的细微变化是柱子与柱子之间选择性变化的主要原因之一。  

ACE和ACE Excel色谱柱由于使用超纯试剂和严格的制造工艺控制（可以获得具有均一表面特性的高纯度硅胶固定相载体）而具有出色的可重现性。  

将这种高纯度硅胶与先进的键合技术相结合，可以产生一系列高惰性的固定相，这些固定相几乎消除了色谱中的硅醇干扰，从而提供zhuo越的柱子与柱子之间的可重现性。  

6.ACE色谱柱可以提供从UHPLC到HPLC再到制备型HPLC的易扩展性。  

相同的质量控制，可以确保不同批次色谱柱的高重现性，也可以保证您更容易地在UHPLC和HPLC方法之间进行转换，或需要分离和纯化目标化合物时放大到制备应用上。  

柱效当然会改变，但可以预料的是，谱带间距（选择性）将相同。  

图14阐明了当使用相同的ACE键合相但不同粒径填充的色谱柱进行操作时，可以预见到分析物一致的谱带间距类型（选择性）。  

图 14：将ACE固定相从UHPLC（2μm）扩展到HPLC（3μm和5μm）再至制备型HPLC（10μm）时，选择性得到了保留与保证。

条件
流动相：35:65 MeCN/0.1%TFA（溶于水中）
温度：22 ℃
波长：254 nm

分析物
1. 尿嘧啶
2. 4-羟基苯甲酸
3. 乙酰水杨酸
4. 苯甲酸
5. 2-羟基苯甲酸
6. 对羟基苯甲酸乙酯

试验样品的这些色谱图在填充有相同的键合相但不同粒径的色谱柱上以相同的流动相条件运行，结果阐明分离从UHPLC扩展到HPLC再到制备型HPLC的容易程度。

当使用ACE Excel UHPLC色谱柱进行快速方法开发，且该方法必须可转移到HPLC时，易扩展性则显得特别有价值。

图 15：ACE固定相可以提供相同的选择性，无论它们是UHPLC、HPLC还是制备型HPLC色谱柱

条件
色谱柱：2.1 x 50 mm
流动相：1.4分钟内从30% B至90% B
A = 20mM甲酸铵+ 0.1％甲酸
B =乙腈+ 0.1％甲酸
梯度：在30％B时持续0.30分钟，在1.10分钟内从30至90％B，在90％B时持续0.40分钟
流速：0.5 mL/min
柱温：30ºC
检测：AB Sciex Triple Quad（TM）5500 MS，以ESI（+）模式运行
仪器：岛津Prominence UFLC系统

分析物
1. 甲苯咪唑
2. 普罗替林
3. 阿米替林
4. 洛哌丁胺

试验样品的这些色谱图在ACE Excel C18 2μmUHPLC色谱柱、ACE C18 3μmHPLC色谱柱和ACE C185μm色谱柱上以相同的流动相条件运行，结果阐明ACE固定相的选择性一致，无论填充粒径如何。

这使得从UHPLC到HPLC或HPLC再到UHPLC的方法转移更加容易。同时也使得从分析型应用扩展到制备型应用更加容易。

ACE色谱柱可以提供从UHPLC到HPLC再到制备型HPLC的易扩展性。

相同的质量控制，可以确保不同批次色谱柱的高重现性，也可以保证您更容易地在UHPLC和HPLC方法之间进行转换，或需要分离和纯化目标化合物时放大到制备应用上。

柱效当然会改变，但可以预料的是，谱带间距（选择性）将相同。

图14阐明了当使用相同的ACE键合相但不同粒径填充的色谱柱进行操作时，可以预见到分析物一致的谱带间距类型（选择性）。

图 14：将ACE固定相从UHPLC（2μm）扩展到HPLC（3μm和5μm）再至制备型HPLC（10μm）时，选择性得到了保留与保证。

条件
流动相：35:65 MeCN/0.1%TFA（溶于水中）
温度：22 ℃
波长：254 nm

分析物
1. 尿嘧啶
2. 4-羟基苯甲酸
3. 乙酰水杨酸
4. 苯甲酸
5. 2-羟基苯甲酸
6. 对羟基苯甲酸乙酯

试验样品的这些色谱图在填充有相同的键合相但不同粒径的色谱柱上以相同的流动相条件运行，结果阐明分离从UHPLC扩展到HPLC再到制备型HPLC的容易程度。

当使用ACE Excel UHPLC色谱柱进行快速方法开发，且该方法必须可转移到HPLC时，易扩展性则显得特别有价值。

图 15：ACE固定相可以提供相同的选择性，无论它们是UHPLC、HPLC还是制备型HPLC色谱柱

条件
色谱柱：2.1 x 50 mm
流动相：1.4分钟内从30% B至90% B
A = 20mM甲酸铵+ 0.1％甲酸
B =乙腈+ 0.1％甲酸
梯度：在30％B时持续0.30分钟，在1.10分钟内从30至90％B，在90％B时持续0.40分钟
流速：0.5 mL/min
柱温：30ºC
检测：AB Sciex Triple Quad（TM）5500 MS，以ESI（+）模式运行
仪器：岛津Prominence UFLC系统

分析物
1. 甲苯咪唑
2. 普罗替林
3. 阿米替林
4. 洛哌丁胺

试验样品的这些色谱图在ACE Excel C18 2μmUHPLC色谱柱、ACE C18 3μmHPLC色谱柱和ACE C185μm色谱柱上以相同的流动相条件运行，结果阐明ACE固定相的选择性一致，无论填充粒径如何。

这使得从UHPLC到HPLC或HPLC再到UHPLC的方法转移更加容易。同时也使得从分析型应用扩展到制备型应用更加容易。

概述

寡核苷酸是一类只有50个以下碱基的短链核苷酸的总称（包括脱氧核糖核酸DNA或核糖核酸RNA的核苷酸）。

近几年，随着寡核苷酸疗法在ZL各种疾病适应症方面取得了临床上显著的进展，已有多种寡核苷酸类药物，如小干扰RNA (siRNA) 和反义寡核苷酸 (ASO) 药物获得了FDA上市批准。另外还有多种microRNA (miRNA) 和适配体 (Aptamer) 正在研发中。因此，更大量、更高纯度的寡核苷酸产品的需求也随之日益增长。

东曹生命科学提供多种具有高分辨率、选择性的色谱柱和层析填料产品以满足从分析到纯化制备不同规模的应用需求。

寡核苷酸的HPLC分离模式

下表中列举了寡核苷酸HPLC分析的几种分离模式及适用的分离条件。也可以通过连用MS进行检测。

ZL性寡核苷酸是由固相化学合成法制成。在合成过程中会产生工艺相关杂质和产品相关杂质。产品相关杂质包含许多目标产物的类似物（分子量的差别：碱基数n-1、n、n+1等），磷酸基S化等的不对称化合物、异构体等。因此，杂质的分析监控对工艺和质量控制就显得十分重要。一般而言，通过阴离子交换色谱法即可实现这一分析需求。

寡核苷酸IEC-HPLC分析

下图是使用TSKgel DNA-STAT阳离子交换色谱柱分离具有不同序列的4种寡核苷酸引物 (单链) 。

在IEC分离模式中，如果使用无孔填料的色谱柱可以提高分辨率。此款色谱柱采用的是亲水性无孔树脂填料，粒径5μm，表面由开放型多层阴离子交换基团构成。这些特性与创新的化学键合方法相结合，使其载量更高、操作压力更低，非常适合于寡核苷酸的高分辨率分析。

寡核苷酸的纯度检测

在离子交换色谱柱中，可以对离子基团与主成分有一处不同的化合物进行分离，比如能够分离n-1、n、n+1的化合物。下图是TSKgel DNA-NPR阳离子交换色谱柱对13个碱基的硫代磷酸寡核苷酸粗样分析的色谱图。

TSKgel DNA-STAT色谱柱对粗制的寡核苷酸与纯化后的样品进行纯度评估。

寡核苷酸的分析要点

1、根据核酸样品的稳定性和大小来选择合适的洗脱液。如果核酸的稳定性很高，可以采用碱性溶液 (NaOH，pH12) 和高温60℃条件下分离，可提高分辨率。如果是稳定性差的，则推荐使用pH7-8的中性洗脱液，温度40℃条件下分离。

2、在样品吸附强的情况下，可使用比NaCl或NaBr洗脱能力更强的NaClO₄进行梯度分离。

3、如果样品是超巨大双链DNA (如质粒DNA)，使用TSKgel DEAE-NPR (4.6mm I.D.×3.5cm) 的话不仅可以获得高分辨率，而且回收率也会更好。

上篇文章《寡核苷酸类药物的HPLC分析 (一) TSKgel IEC色谱柱应用例》中我们提到了随着寡核苷酸药物的研发步伐越来越快，对高纯度寡核苷酸产品的需求也日趋旺盛。目前，寡核苷酸主要是通过化学合成法制成，在合成过程中会产生工艺相关杂质和产品相关杂质，离子交换液相色谱法是分析这些杂质的重要手段之一。此篇文章我们将介绍尺寸排阻色谱法在寡核苷酸药物质量控制中的应用。

在寡核苷酸的分析中，尺寸排阻分离模式是基于碱基数量、磷酸基不同导致的分子量差别进行分离，通常用于简单的质量控制或纯度研究。该模式的优点是可以使用接近生理条件的洗脱溶液进行等度分离。有时也会添加水溶性有机溶剂来YZ疏水吸附。

分析不同碱基数目的寡核苷酸

下图是采用两根串联的SEC色谱柱TSKgel UP-SW2000来区分长度相差一个碱基的寡核苷酸混合物 (20-mer和N-1 19-mer)。

TSKgel UP-SW2000是东曹生命科学ZX开发的粒径2μm、孔径12.5nm的硅胶基质SEC色谱柱，主要用于分离分子量范围为1-150kDa的小蛋白、肽和寡核苷酸等生物分子。该色谱柱兼容HPLC和UHPLC系统，因此也能够从传统的HPLC-SEC方法转换到UHPLC。

下图是使用TSKgel G2000SWXL色谱柱分离不同碱基数量的合成寡核苷酸混合物的谱图。为了YZ核酸酶活性，有时会在流动相中添加EDTA等约1 mmol/L的螯合剂。

SEC法分离脂质体包被的siRNA

下图是使用TSKgel SuperSW2000色谱柱对天然型DNA核酸药物Defitelio进行质量分析的示例。

参考文献：Handbook of analysis of oligonucleotides and related Products, Feb.23 (2011) 125, Edited by J.V. Bonilla et al.

寡核苷酸分析用SEC色谱柱

下表中列出了适用于核酸分离的SEC色谱柱。对于＜375 bp的短链核酸或寡核苷酸，UP-SW3000、UP-SW2000、G3000SWXL以及G2000SWXL这几款色谱柱都是比较推荐的。