寡核苷酸类药物的HPLC分析 (一) TSKgel IEC色谱柱应用例

概述

寡核苷酸是一类只有50个以下碱基的短链核苷酸的总称（包括脱氧核糖核酸DNA或核糖核酸RNA的核苷酸）。

近几年，随着寡核苷酸疗法在ZL各种疾病适应症方面取得了临床上显著的进展，已有多种寡核苷酸类药物，如小干扰RNA (siRNA) 和反义寡核苷酸 (ASO) 药物获得了FDA上市批准。另外还有多种microRNA (miRNA) 和适配体 (Aptamer) 正在研发中。因此，更大量、更高纯度的寡核苷酸产品的需求也随之日益增长。

东曹生命科学提供多种具有高分辨率、选择性的色谱柱和层析填料产品以满足从分析到纯化制备不同规模的应用需求。

寡核苷酸的HPLC分离模式

下表中列举了寡核苷酸HPLC分析的几种分离模式及适用的分离条件。也可以通过连用MS进行检测。

ZL性寡核苷酸是由固相化学合成法制成。在合成过程中会产生工艺相关杂质和产品相关杂质。产品相关杂质包含许多目标产物的类似物（分子量的差别：碱基数n-1、n、n+1等），磷酸基S化等的不对称化合物、异构体等。因此，杂质的分析监控对工艺和质量控制就显得十分重要。一般而言，通过阴离子交换色谱法即可实现这一分析需求。

寡核苷酸IEC-HPLC分析

下图是使用TSKgel DNA-STAT阳离子交换色谱柱分离具有不同序列的4种寡核苷酸引物 (单链) 。

在IEC分离模式中，如果使用无孔填料的色谱柱可以提高分辨率。此款色谱柱采用的是亲水性无孔树脂填料，粒径5μm，表面由开放型多层阴离子交换基团构成。这些特性与创新的化学键合方法相结合，使其载量更高、操作压力更低，非常适合于寡核苷酸的高分辨率分析。

寡核苷酸的纯度检测

在离子交换色谱柱中，可以对离子基团与主成分有一处不同的化合物进行分离，比如能够分离n-1、n、n+1的化合物。下图是TSKgel DNA-NPR阳离子交换色谱柱对13个碱基的硫代磷酸寡核苷酸粗样分析的色谱图。

TSKgel DNA-STAT色谱柱对粗制的寡核苷酸与纯化后的样品进行纯度评估。

寡核苷酸的分析要点

1、根据核酸样品的稳定性和大小来选择合适的洗脱液。如果核酸的稳定性很高，可以采用碱性溶液 (NaOH，pH12) 和高温60℃条件下分离，可提高分辨率。如果是稳定性差的，则推荐使用pH7-8的中性洗脱液，温度40℃条件下分离。

2、在样品吸附强的情况下，可使用比NaCl或NaBr洗脱能力更强的NaClO₄进行梯度分离。

3、如果样品是超巨大双链DNA (如质粒DNA)，使用TSKgel DEAE-NPR (4.6mm I.D.×3.5cm) 的话不仅可以获得高分辨率，而且回收率也会更好。

上篇文章《寡核苷酸类药物的HPLC分析 (一) TSKgel IEC色谱柱应用例》中我们提到了随着寡核苷酸药物的研发步伐越来越快，对高纯度寡核苷酸产品的需求也日趋旺盛。目前，寡核苷酸主要是通过化学合成法制成，在合成过程中会产生工艺相关杂质和产品相关杂质，离子交换液相色谱法是分析这些杂质的重要手段之一。此篇文章我们将介绍尺寸排阻色谱法在寡核苷酸药物质量控制中的应用。

在寡核苷酸的分析中，尺寸排阻分离模式是基于碱基数量、磷酸基不同导致的分子量差别进行分离，通常用于简单的质量控制或纯度研究。该模式的优点是可以使用接近生理条件的洗脱溶液进行等度分离。有时也会添加水溶性有机溶剂来YZ疏水吸附。

分析不同碱基数目的寡核苷酸

下图是采用两根串联的SEC色谱柱TSKgel UP-SW2000来区分长度相差一个碱基的寡核苷酸混合物 (20-mer和N-1 19-mer)。

TSKgel UP-SW2000是东曹生命科学ZX开发的粒径2μm、孔径12.5nm的硅胶基质SEC色谱柱，主要用于分离分子量范围为1-150kDa的小蛋白、肽和寡核苷酸等生物分子。该色谱柱兼容HPLC和UHPLC系统，因此也能够从传统的HPLC-SEC方法转换到UHPLC。

下图是使用TSKgel G2000SWXL色谱柱分离不同碱基数量的合成寡核苷酸混合物的谱图。为了YZ核酸酶活性，有时会在流动相中添加EDTA等约1 mmol/L的螯合剂。

SEC法分离脂质体包被的siRNA

下图是使用TSKgel SuperSW2000色谱柱对天然型DNA核酸药物Defitelio进行质量分析的示例。

参考文献：Handbook of analysis of oligonucleotides and related Products, Feb.23 (2011) 125, Edited by J.V. Bonilla et al.

寡核苷酸分析用SEC色谱柱

下表中列出了适用于核酸分离的SEC色谱柱。对于＜375 bp的短链核酸或寡核苷酸，UP-SW3000、UP-SW2000、G3000SWXL以及G2000SWXL这几款色谱柱都是比较推荐的。

甜菜碱（Betaine）是一种生物碱，天然存在于很多动植物体内。其分子内有3个有效甲基，作为甲基提供者参与合成蛋氨酸，在营养物质的代谢中起着十分重要的作用。甜菜碱在医药、化妆品、食品发酵和饲料工业等多个行业中都有广泛的应用。

本应用参照行业标准NY/T 2947-2016，按GX液相色谱法，采用亲水作用多孔硅胶色谱柱TSKgel Amide-80 (3 μm, 4.6 mm I.D. × 15 cm) 来测定甜菜碱的含量。分析结果表明，该色谱柱完全满足标准中对甜菜碱分离检测的要求。

溶液配制

样品稀释液：75% 乙腈-水溶液。

用样品稀释液将甜菜碱储备液 (2 mg/mL) 序列稀释得到浓度为0 μg/mL，20 μg/mL，50 μg/mL，100 μg/mL，200 μg/mL，500 μg/mL，1000 μg/mL，2000 μg/mL的标准工作液，依次由低到高进样检测。

分析条件

色谱柱：TSKgel Amide-80 (3μm, 4.6mmI.D. ×15cm)

流动相：乙腈-水，梯度洗脱

流速：1.0 mL/min

柱温：30℃

紫外检测器：205 nm

进样量：10 μL

流动相梯度洗脱程序见下表：

分析结果

图1.  甜菜碱2000 μg/mL检测图谱

图2.  甜菜碱标准曲线（标准方差=0.99997）

        大家都知道HPLC色谱柱的寿命是有限的，在使用过程中随着时间的推移，其性能开始下降。你可以通过峰形和峰形之间的分离，柱背压的不规律增加以及重影峰的出现来判断HPLC色谱柱的性能出现了下降。色谱柱是昂贵的色谱耗材，平常使用完毕后需要保养。如果色谱柱真的发生了性能下降，有什么方法可以恢复呢?

        首先，如果色谱柱由于过载或使用不兼容的流动相而结垢，是可以恢复的，但已经损坏的色谱柱或已经过使用寿命的色谱柱无法恢复，需要更换。

        色谱柱还原程序如下，供大家参考：

        反相柱

        反相分离是大多数HPLC分离中使用的主要操作模式。填料主要由C18，C4，CN，NH2和苯基固定相组成。建议以水-乙腈-异丙醇-庚烷-异丙醇-乙腈-流动相的顺序用10至20倍体积的溶剂洗脱

        正相柱（氨基，二醇，硝基，氨基固定相）

        用20倍体积的溶剂冲洗，按照庚烷-异丙醇-乙腈-

       水-异丙醇-庚烷的顺序。

        GPC / GFC色谱柱

        用5倍体 积且PH值为3的0.1%磷酸盐缓冲液冲洗。如果使用了保留力强的蛋白质，则使用从水到乙腈再到水的60分钟梯度液冲洗。

        色谱柱在使用前都要对其性能进行考察，使用期间或放置一段时间后也要重新检查，并将结果保存起来，作为今后评价柱性能变化的参考。柱性能指标包括在一定实验条件下（样品、流动相、流速、温度）下的柱压、理论塔板高度和塔板数、对称因子、容量因子和选择性因子的重复性，或分离度。进行柱效比较时，还要注意柱外效应是否有变化。但要注意：柱性能可能由于所使用的样品、流动相、柱温等条件的差异而有所不同；另外，在做柱性能测试时是按照色谱柱出厂报告中的条件进行（出厂测试所使用的条件是zui佳条件），只有这样，测得的结果才有可比性。

        恒谱生色谱柱柱管由不锈钢制成，不锈钢柱内壁多经过抛光，减小管壁效应，提高柱效，柱中填充键合硅胶或聚合物填料。色谱柱基于高纯硅胶，采用独特键合技术，具有优异的峰形，灵敏性好。基质金属含量低，对所有类型的分析物均表现完好峰形。机械强度高，稳定性好，质控严格，确保色谱柱性能和色谱柱的使用寿命。有多种尺寸规格可供选择以适应色谱工作者及其使用的不同需求。我们有专业的技术工程师团队为您的需求提供解决方案，欢迎前来咨询了解！

GX液相色谱柱是消耗品，会随着使用时间或进样次数的增加，出现柱效下降无法达到分离要求，或伴有峰型拖尾、分叉等情况。需要定期进行清洗和再生，以保证色谱柱的柱效和使用寿命。

不同类型的色谱柱都有与之对应的清洗方法。本文为大家介绍TSKgel SW系列硅胶尺寸排阻色谱柱的清洗方法。

根据样品性质，建议先从以下①和②中选择适当的清洗方法，每一步清洗之间用纯水冲洗。清洗色谱柱时的流速与溶剂替换流速一致。

1 去除离子性杂质

使用高盐浓度的流动相（例如：0.5M硫酸钠，pH3溶液）或酸性水溶液（例如：磷酸盐缓冲液，pH2.5）过柱清洗。

2 去除疏水性杂质

在清洗液中添加10-20%的甲醇、乙腈等水溶性有机溶剂过柱清洗。

如果采用上述两种方法清洗后色谱柱性能仍不能恢复，再考虑以下第③种方法。

3 去除难溶性蛋白质或其他物质

在清洗液中添加6-8mol/L的尿素或0.2-0.3%的中性表面活性剂（Triton、Tween、Brij等）后过柱清洗。但需要留意的是尿素或中性表面活性剂可能会残留在色谱柱上。

一般来说，清洗时间可选择为过柱5-10个柱体积便可。在吸附成分其吸附力极强时，即使进行过清洗，色谱柱性能也有可能得不到恢复。另外，请充分考虑清洗液的pH值，以避免损坏色谱柱。

氨基酸作为构成多肽和蛋白的基本单元，是非常重要的一类化合物。
随着生物药的逐渐兴起，作为原料的氨基酸的质量分析的需求也越来越大。
大部分氨基酸由于至少同时含有大极性的氨基和羧基，因此整体极性很大，常用的C18柱+反相流动相对其保留很弱，同时部分氨基酸由于紫外吸收很弱，因此让流动相和检测器的选择更有挑战。

本文系统总结广州菲罗门积累经典色谱应用，包括氨基酸衍生化分析、非衍生氨基酸直接分析、保护型氨基酸的手性分析以及非保护型氨基酸直接手性分析四种广受关注的应用。

一、氨基酸衍生化分析
氨基酸衍生的方法比较多，最常用的是AQC衍生和PITC衍生。
虽然过程相对繁琐，但是通过衍生后，一举解决了氨基酸分析的两个难点：
保留和紫外吸收。
通过衍生反应在氨基酸上接上疏水且有紫外吸收的基团，可以实现在C18柱+反相流动相的体系下进行HPLC分析。

AQC衍生法：

 PITC衍生法：

二、非衍生氨基酸直接分析

当选择氨基酸非衍生直接分析时，对于有些疏水性比较好的氨基酸，可以直接用C18类柱子分析，比如：

可以选用带有HILIC作用的色谱柱实现保留，当使用磷酸盐类时，可以在截止波长条件下用UV检测，比较经典的应用是用ACE HILIC-B检测门鸟氨酸：

菲罗门也推出Comix系列智能神柱，可以在以ELSD、 CAD或者MS为检测器的条件下分析氨基酸。

三、保护型氨基酸手性分析

当氨基酸上的氨基和羧基用Boc和/或FMOC等保护起来时，可以用正相或者反相的多糖类手性柱实现非常好的分离，有现成的分析方法，可以极大地减少方法开发的时间。

四、非保护氨基酸直接手性分析

对于非保护的氨基酸，菲罗门推出AAOA分析柱，即通过键合D-青霉胺于十八烷基柱上而成的配体交换型手性柱。该手性柱手性柱可以用于拆分α-型有机酸、α-型非衍生氨基酸及其衍生物、二元胺、二肽、内酰胺和氨基醇等。

到目前为止，我们已经实现了有机酸如D, L-乳酸、D, L-酒石酸的拆分，也实现了氨基酸如D, L-丙氨酸，D, L-天门冬氨酸，D, L-缬氨酸，D, L-脯氨酸：

总结: 本文全面总结了氨基酸类的HPLC分析方法，包括氨基酸衍生化分析、非衍生氨基酸直接分析、保护型氨基酸的手性分析以及非保护型氨基酸直接手性分析。

对于具体氨基酸的分析如有疑问，可以电话020-22826668找到您专属的技术工程师。

氨基酸作为构成多肽和蛋白的基本单元，是非常重要的一类化合物。

随着生物药的逐渐兴起，作为原料的氨基酸的质量分析的需求也越来越大。
大部分氨基酸由于至少同时含有大极性的氨基和羧基，因此整体极性很大，常用的C18柱+反相流动相对其保留很弱，同时部分氨基酸由于紫外吸收很弱，因此让流动相和检测器的选择更有挑战。

本文系统总结广州菲罗门积累经典色谱应用，包括氨基酸衍生化分析、非衍生氨基酸直接分析、保护型氨基酸的手性分析以及非保护型氨基酸直接手性分析四种广受关注的应用。

一、氨基酸衍生化分析
氨基酸衍生的方法比较多，最常用的是AQC衍生和PITC衍生。
虽然过程相对繁琐，但是通过衍生后，一举解决了氨基酸分析的两个难点：
保留和紫外吸收。
通过衍生反应在氨基酸上接上疏水且有紫外吸收的基团，可以实现在C18柱+反相流动相的体系下进行HPLC分析。

AQC衍生法：

 PITC衍生法：

二、非衍生氨基酸直接分析

当选择氨基酸非衍生直接分析时，对于有些疏水性比较好的氨基酸，可以直接用C18类柱子分析，比如：

可以选用带有HILIC作用的色谱柱实现保留，当使用磷酸盐类时，可以在截止波长条件下用UV检测，比较经典的应用是用ACE HILIC-B检测门鸟氨酸：

菲罗门也推出Comix系列智能神柱，可以在以ELSD、 CAD或者MS为检测器的条件下分析氨基酸。

三、保护型氨基酸手性分析

当氨基酸上的氨基和羧基用Boc和/或FMOC等保护起来时，可以用正相或者反相的多糖类手性柱实现非常好的分离，有现成的分析方法，可以极大地减少方法开发的时间。

四、非保护氨基酸直接手性分析

对于非保护的氨基酸，菲罗门推出AAOA分析柱，即通过键合D-青霉胺于十八烷基柱上而成的配体交换型手性柱。该手性柱手性柱可以用于拆分α-型有机酸、α-型非衍生氨基酸及其衍生物、二元胺、二肽、内酰胺和氨基醇等。

到目前为止，我们已经实现了有机酸如D, L-乳酸、D, L-酒石酸的拆分，也实现了氨基酸如D, L-丙氨酸，D, L-天门冬氨酸，D, L-缬氨酸，D, L-脯氨酸：

总结: 本文全面总结了氨基酸类的HPLC分析方法，包括氨基酸衍生化分析、非衍生氨基酸直接分析、保护型氨基酸的手性分析以及非保护型氨基酸直接手性分析。

对于具体氨基酸的分析如有疑问，可以电话020-22826668找到您专属的技术工程师。

引言

反相HPLC已成为分离和分析蛋白质和多肽的重要工具。

它在生物技术行业中被广泛应用于蛋白质类ZL产品的表征，以及这些产品和杂质的鉴定。

在通过质谱鉴定蛋白质之前，反相HPLC在从消化后的蛋白质组中分离多肽方面有着至关重要的作用。

它也被用于探索性研究中多种蛋白质和多肽的纯化，以及蛋白类ZL药物的大规模纯化。

反相HPLC灵敏、通用性强，还可与质谱等技术结合使用，在蛋白质研究中具有重要的地位。

此外，它还能够分离结构近乎相同的蛋白质，因而得到了广泛的应用。

正如牛、人和猪胰岛素变异体的分离过程所示（图1），反相HPLC能够分离非常相似的蛋白质。

牛胰岛素和人胰岛素仅有三个氨基酸的差别，也能够被完全分离开来。

牛胰岛素在胰岛素“a”链的第8位为丙氨酸，第10位为缬氨酸，“b”链的第30位为丙氨酸。

而人胰岛素在胰岛素“a”链的第8位为苏氨酸，第10位为异亮氨酸，“b”链的第30位为苏氨酸。

图1. 以RP-HPLC对紧密关联的胰岛素变异体进行分离

猪胰岛素和人胰岛素仅有一个氨基酸的差异（猪胰岛素的“b”链第30位为丙氨酸，人胰岛素该位置为苏氨酸），在基线即已分离。  

在另一个实例中，尽管兔胰岛素和人胰岛素仅有一个氨基酸的差异，即以苏氨酸取代了丝氨酸，但也同样得到了分离（参考文献1）。  

反相HPLC的高分离能力也被扩展应用到了多肽上。  

在图2中，两种多肽尽管只有一个氨基酸的差异，即丝氨酸对苏氨酸，但也得到了完全的分离。  

这种高分离能力是反相HPLC在蛋白质和多肽分离中得到广泛应用的基础性因素。  

图2. 以RP-HPLC对紧密关联的多肽进行分离。仅有一个氨基酸不同的两种十肽菌素，一种含丝氨酸，而另一种含苏氨酸。  

蛋白质/多肽的保留机制  

在反相HPLC中，颗粒表面是十分疏水的，因为其表面通过化学连接有羟基（图3中的波浪形红线）。  

通过疏水表面对蛋白质一面（被称为“疏水性足”）的吸附，蛋白质被保留下来（图3）。  

与疏水表面的厚度相比，蛋白质要大得多，因此蛋白质仅有一部分被疏水表面所吸附。  

大部分蛋白质位于表面上方并与流动相接触。  

由这种疏水性吸附所导致的净相互作用非常强，会导致蛋白质保持吸附在表面上（图4A），直至接触到特定浓度的有机溶剂，这时蛋白质会从表面上解吸附并从色谱柱上洗脱（图4B）。  

在Z初的吸附/解吸附之后，尽管蛋白质在从色谱柱上移动下来时仍会与表面产生一些相互作用，但却是十分微弱的，对分离过程无影响。  

分离是由单次吸附/解吸附过程完成的。  

解吸蛋白质所需要的有机改性剂的浓度十分精确，并与疏水足的大小呈函数关系。  

详情请参阅参考文献3。  

图4. 进入色谱柱的蛋白质被吸附在柱顶端附近的疏水表面上（A）并且一直保持吸附，直至有机改性剂的浓度达到特定值，此时蛋白质从表面解吸附（B）。  

在反相HPLC中，吸附/解吸保留机制导致蛋白质的保留行为与小分子不同。  

小分子的保留行为随着有机溶剂浓度的改变而缓慢改变时（图5，联苯），一旦有机溶剂的浓度达到所需要的值，蛋白质的保留行为即发生突然改变，引起保留时间的快速变化（图5，蛋白质）。  

该过程产生的尖锐峰形常见于蛋白质和多肽（图6A）。  

由于有机溶剂浓度的微小变化会引起的显著的保留行为变化，等度洗脱很少被用于蛋白质中，因为峰变宽了，而有机溶剂的微小改变会导致蛋白质保留行为的巨大变化（图6B）。

图5.有机溶剂浓度对应的保留行为  

图6.  

A. 梯度洗脱过程中多肽和蛋白质洗脱出尖锐峰形。  

B. 等度洗脱下，蛋白质的峰形（本例中为溶菌酶）很宽，有机溶剂的微小改变都会引起保留时间的巨大变化。  

         液相色谱仪除了日常维护保养外，使用高纯度溶剂不仅能保护液相系统，也能增加结果的可靠性。HPLC级表示化学试剂的纯度，是可在GX液相色谱中使用的试剂的纯度，制备色谱法、平行分析或梯度分析需要使用到不同的HPLC级试剂。

         样品在注入液相系统前，必须选择一种合适的HPLC溶剂。在反相GX液相色谱中，当样品溶剂与流动相的洗脱强度有差异,尤其是前者的洗脱强度较强时,就会产生峰的变形及柱效的降低。解决该问题最有效的方法是使用流动相作为溶剂溶解样品,这样既可以避免样品溶剂和流动相之间任何强度或粘度的不匹配，也可以减少样品分析时基线的漂移。溶剂在流动相中起着重要的作用，并有助于将进样品通过分离柱后输送到检测器。为了满足不同的分析要求，可以购买不同纯度等级的溶剂来使用，HPLC分析需要使用高纯度的溶剂，但是同时也要考虑成本和实用性等方面。

         HPLC级溶剂的纯度通常超过99.9％，并且瓶身标签上还会标明其他杂质的含量。但是杂质会导致多余的峰，从而干扰色谱图中的主峰，对我们的分析结果产生干扰。杂质产生的原因有很多，可能溶剂纯度不够，可能是瓶身不干净或者软管不干净，还可能是溶剂吸滤头的过滤杂质效果不好。恒谱生不锈钢流动相进样口过滤器能安全有效地保护泵和止回阀，尺寸小，适用于各种品牌的HPLC系统和多种小瓶口的存储池容器。吸滤阻力较小，几乎没有背压和形成空化，兼容多种流动相管路，无需换吸滤头即可配不同规格的吸管，过滤微粒污染物效果好，无气泡，溶剂利用率高。

        在整个紫外线可见波长范围内，没有溶剂是100％透明的，常用的HPLC溶剂在一定波长范围内显示出透明性。大多数应用中会使用紫外线检测器，因此所选的溶剂应该尽可能具有低的紫外线截止波长，让大多数的样品组分在高于截止值的波长处显示出可测量的吸收度。除此之外，溶剂的粘度越高，填充柱中固定相的阻力将导致背压越高，因此所选溶剂也应具有低粘度才是比较理想的。

        大多数的溶剂在密封瓶中才能维持它的稳定性，但某些溶剂的保存期限有限。使用时要注意查看使用期，注意在有效期内使用，不要购买过多的溶剂避免ZH用不完产生了浪费行为。

      作为ZH的建议，所有溶剂在使用前通过进样口过滤器过滤并脱气，这样的预防措施将提高HPLC系统的使用寿命，也有助于增加分析结果的可靠性。

        误区1：HPLC 柱不可以反冲

        这是不正确的。通常情况下液相色谱柱所设计的耐压值是远高于最da操作压力的。换柱时反冲可以清洗柱头一些具有强吸附性质的物质，我们冲洗出这些残留物质也是为了防止压力增大。但是如果你购买的色谱柱在柱头使用了大粒度的填料，这时你反冲会冲出这一部分填料。因此你要先检查一下自己使用的液相色谱柱再选择是否反冲。

        误区2：所有的C18（L1）色谱柱都是一样的

        这是不正确的。在早期的HPLC体系中，C18是唯yi反向色谱的键合固定相，因此C18就作为了反向色谱柱的标准。但是时代不会一直停滞脚步，人们对于科学的追求与理解愈发深刻，更多的固定相出现了，诞生了许多C18色谱柱。虽然同样是选用硅胶作为基体，但各自都有自己特定的填料键合合成工艺，因此色谱性能也不相同。所以单纯的因为名称都是C18色谱柱，想当然觉得性能都一样是不对的。

        误区3：色谱柱里一旦进入空气就会损坏

        我们都知道当色谱柱不与色谱仪连接的时候，需确保色谱柱被紧紧地密封。但是在实际应用中，即使色谱柱的端部进入了少量的空气也不是很严重的事情。当色谱柱连接到色谱仪上使用时，在系统初始加压阶段，在很短的时间内空气就会被溶剂挤压排出。所以，不要因为色谱柱进入了少量空气就认为色谱柱已被损坏。

        误区4：保护柱是没必要的

        这也是太JD的误区，其实使用保护柱有很多好处。HPLC的移动相中常使用各种试剂，其中会混有一些不溶解物质或不纯物质。多数不溶物通过使用筛板或膜滤器过滤移动相可以除去，但极细小的粒子还是无法完全过滤。此外在移动相调制之后，还有通过空气、容器、人体等有不溶物、不纯物落入的可能性。这些不溶物、不纯物质会污染柱、或使堵塞、或给分析带来不良影响等。这时通过在色谱柱前安装分析保护柱可以防止其产生，能起保护色谱柱的作用。相较于更换一根昂贵的分析柱，添加或更换保护柱只需要很少的花费。恒谱生液相色谱保护柱几乎无死体积、便于更换，适用于UHPLC系统的高压，将那些强保留的、不可吸附的化合物截留下来。样品和流动相的过滤可以维护保护柱对化学污染物的吸附容量，能够更长时间的维护柱效，延长色谱柱的使用寿命。

        误区5：反相色谱柱不可以使用纯水相

        这也是不正确的，有些色谱工作者在使用低有机溶剂含量或者纯水作为反相色谱柱的流动相时，发生相塌陷的现象，所以有些人认为反相色谱柱不可以使用纯水相。但事实上市场上销售的反相色谱柱（如极性嵌入和极性封端柱）都是具有水浸润性的，其表面特性是允许使用纯水的，不会导致塌陷或者保留时间移位。

        误区6：色谱柱填料粒径越小、压力越高，分离效果越好

　　色谱柱性能的好坏不能单纯用填料是否是超小的粒径以及超高的柱压来评估。现代对于色谱柱的柱特性研究越来越深入，已经研发了一些能够提高色谱柱柱效的方法。例如，采用新的表面多孔材料的色谱柱，其柱效与sub-2µm UHPLC柱效一样好，与常规的LC填料色谱柱比起来，柱压很低。

　　误区7：柱压不会影响色谱分离效果

        近年来，柱压的问题引起了很多色谱工作者的注意，柱压是色谱的很多参数都是受柱压影响的，包括部分溶质的摩尔体积、停滞体积、柱孔隙度、保留因子、流动相密度、介电常数、固定相结构、pH值和电离常数等。当色谱柱在约2000psi（13.789MPa）压力下运行时，即使保留时间上存在小差异，也并不会引起我们的注意；特别是如果重复性较好及定量不受影响的时候。但是，当柱压接近2000psi（13.789MPa）时，柱压的影响可能就相当明显了。

        近几十年来，液相色谱法被广泛应用于生命科学领域，药物分析，食品分析，环境监测等领域，人们对于液相色谱法的不断研究，也诞生出更多的液相色谱应用以及解决方法等，相信未来液相色谱法的应用领域会更加广阔。

ACE色谱柱柱前过滤器
使用Advanced Chromatography Technologies的品质柱前过滤器可以保护您的HPLC和UHPLC色谱柱免于过早失效。
HPLC色谱柱失效的Z常见原因之一是色谱柱入口筛板上聚集的颗粒物质，导致背压较高和/或峰形变形。

据估计，超过70％的HPLC色谱柱失效是由入口筛板堵塞引起的。UHPLC色谱柱（特别是那些用2µm以下颗粒填充的色谱柱）特别容易受入口筛板堵塞的影响。
Advanced Chromatography Technologies可以提供三种不同的柱前过滤器，每种过滤器均为色谱柱的特殊保护而设计。

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