采用HILIC色谱柱TSKgel Amide-80测定甜菜碱的含量

甜菜碱（Betaine）是一种生物碱，天然存在于很多动植物体内。其分子内有3个有效甲基，作为甲基提供者参与合成蛋氨酸，在营养物质的代谢中起着十分重要的作用。甜菜碱在医药、化妆品、食品发酵和饲料工业等多个行业中都有广泛的应用。

本应用参照行业标准NY/T 2947-2016，按GX液相色谱法，采用亲水作用多孔硅胶色谱柱TSKgel Amide-80 (3 μm, 4.6 mm I.D. × 15 cm) 来测定甜菜碱的含量。分析结果表明，该色谱柱完全满足标准中对甜菜碱分离检测的要求。

溶液配制

样品稀释液：75% 乙腈-水溶液。

用样品稀释液将甜菜碱储备液 (2 mg/mL) 序列稀释得到浓度为0 μg/mL，20 μg/mL，50 μg/mL，100 μg/mL，200 μg/mL，500 μg/mL，1000 μg/mL，2000 μg/mL的标准工作液，依次由低到高进样检测。

分析条件

色谱柱：TSKgel Amide-80 (3μm, 4.6mmI.D. ×15cm)

流动相：乙腈-水，梯度洗脱

流速：1.0 mL/min

柱温：30℃

紫外检测器：205 nm

进样量：10 μL

流动相梯度洗脱程序见下表：

分析结果

图1.  甜菜碱2000 μg/mL检测图谱

图2.  甜菜碱标准曲线（标准方差=0.99997）

ACE HILIC色谱柱检测器兼容性

HILIC是一种能很好兼容众多主流检测器的技术。因此，检测的（检测器的）选择受检测器可用性、所需的检测限制和分析物的理化特性（即：具有发色团或电荷）等综合因素的影响。

UV-Vis检测器

UV-Vis检测器是分析试验室中Z常见的检测器之一。

根据仪器的不同，一次可记录多个波长，以优化分析物覆盖范围。

有时，混合物中的分析物可通过参考紫外光谱库来快速识别。

图10中的例子示出了五种β受体阻滞剂的分离，这些阻滞剂可通过他们不同的图谱清楚识别（识别清楚）。

图10
五种β受体阻滞剂的色谱图和紫外光谱
色谱柱：ACE 5 HILIC-N，150 x 4.6 mm
流动相：10 mM甲酸铵pH3.0（溶于MeCN/H2O中）（90:10 v/v）
流速：1.5 mL/min
温度：25 °C
检测：UV, 214 nm
样本：
1) 普萘洛尔
2) 醋丁洛尔
3) 索他洛尔
4) 沙丁胺醇
5) 阿替洛尔

折射率检测器

示差折光测器（RID）测量当通过检测器时分析物峰相对参考溶剂（即流动相）的折射率。如果这二者之间存在差别，色谱图中可观察到峰。

RID对缺乏活性发色团的分析物很有用，尤其常用于糖分分析。
RID存在几个方面的劣势。这些劣势包括灵敏度受限和没有峰相关的信息（峰的身份通常需要单独的标准来验证）。

此外，RID只能用于等度条件，因为洗脱剂（洗脱剂组成变化）会改变折射率响应。

作为物理测量，折射率也很受温度的影响，也就是说，基线噪声和再现（重现）性会发生变化。

蒸发光散射检测器

蒸发光散射检测器（ELSD）通过如下方式工作：从LC上喷射输出洗脱液与惰性气体（通常为氮气），以形成液滴在加热室内去溶剂化。

去溶剂化后的分析物被分散的光源击中，然后进行检测（喷射出惰性气体来雾化从LC中输出的洗脱液，形成液滴后在加热管中蒸发，去溶剂的分析物被分散的光源击中然后进行检测）。

探测器（ELSD）需要挥发性洗脱剂，以使HILIC非常适合（HILIC方法就非常适合这款检测器）。ELSD是RID有效的替代选择，因为它非常适合非（无）发色团分析物，灵敏度更高，并且适用于梯度色谱法。

但是，ELSD不提供光谱信息，因此在没有标准的情况下，较难识别峰值（峰的识别很困难）。
对于HILIC分离（分析物），ELSD对发色团有限（有限发色团）的极性分析物更有利，例如甲基丙二酸（MMA）和琥珀酸（图11）。

MMA用作维生素B12缺乏症的生物标志，但琥珀酸与MMA等压（元素相同），因此必须彻底解决以防止假阳性结果。

采用ELSD的HILIC法，其MMA量化比紫外线检测法更好。

图11
甲基丙二酸和琥珀酸的色谱图
色谱柱：ACE 5 HILIC-B,
150 x 4.6 mm
流动相：10 mM
甲酸铵pH3.0（溶于MeCN/H2O中）（90:10 v/v）
流速：1.5 mL/min
温度：25 °C
检测：ELSD
样本：
1) 琥珀酸
2) MMA

质谱仪

质谱仪（MS）是LC分离中信息Z丰富的检测技术。

LC的洗脱剂流通常使用惰性气体（如氮气）去溶剂化（LC流出的洗脱液在加热管中被惰性气体去溶剂化），并在检测前电离。

可使用不同的质谱分析仪，如：四极质谱仪、飞行时间质谱仪、离子阱质谱仪等。有机物含量较高的HILIC洗脱剂特别适合MS检测。

有多个电离源可用，根据具体应用进行选择。

喷雾电离质谱（ESI）很常用，但也使用电晕放电和光电离源。MS具有高度专一性，因为可利用选择性离子检测（SIM）进行跟踪（因为可以使用选择离子性监测来跟踪单个物质的荷质比（m/z），得到更好的选择性），提高灵敏度。MS还可以在不同质量范围内执行扫描，这对未知的样本（样品）很有帮助。

但是，MS扫描通常灵敏度小得多。（具有更小的灵敏度。）

MS可用于检测发色团较弱或者没有发色团的分析物。

作为一种识别工具，MS对HILIC应用也很有帮助，这种应用中分析物具有相似的紫外光谱特性，但质量不同（在HILIC应用中，当分析物具有相似的紫外光谱特性，但质量不同，MS是很有用的识别工具）。

核酸碱基和核苷就是一个很好的HILIC例子。极性分析物腺嘌呤、腺苷和2’-脱氧腺苷的紫外光谱非常相似（图12）。

图12
腺嘌呤、腺苷和2’-脱氧腺苷的紫外光谱对比
蓝色轨迹：腺嘌呤
红色轨迹：腺苷
绿色轨迹：2’-脱氧腺苷
色谱柱：ACE 5 HILIC-N，150 x 4.6 mm
流动相：10 mM甲酸铵，pH4.7（溶于MeCN/H2O中）（90:10 v/v）
流速：1.5 mL/min
温度：25 °C
检测：UV
进样量：2 μL

MS可利用这些分析物不同的质荷比进行检测和识别峰（图13）。SIM用于提高灵敏度。

图13
利用UV和MS联合检测法分析ACE HILIC-N的腺嘌呤和核苷
（a）下列物质的紫外光色谱图：
1) 2’-脱氧腺苷（m/z 252.4）
2) 腺嘌呤（m/z 136.1）
3) 腺苷（m/z 268.3）
(b) 通过MS SIM确认峰
色谱柱：ACE 5 HILIC-N，150 x 4.6 mm
流动相：10 mM甲酸铵，pH4.7（溶于MeCN/H2O中）（90:10 v/v）
流速：1.5 mL/min
温度：25 °C
检测：UV，254nm和MS

HILIC分离机制

HILIC是一种复杂的分离技术，通过多种相互作用模式来实现保留。

这些相互作用的权重（中哪种是主要作用）是基于固定相、流动相和分析物的理化特性。

为了得到可靠和稳健的HILIC方法，了解潜在的不同相互作用（了解可能存在的不同相互作用）是很有帮助的。

这样可以为待进行的方法开发合理选择色谱柱和条件。（这样可以为方法开发的色谱柱和条件做出合理的选择）
HILIC中的流动相通常包含大量的乙腈（>70%）以及至少3%的水。

水性组分使得极性固定相周围存在亲水环境，并且形成吸附水层以便分析物分散（分配）。

主要的HILIC保留机制包括：
分析物分散（分配）到吸附水层，各种极性相互作用和静电（即离子交换式）相互作用（参见图3）。

如果将极性分析物通入（极性分析物进入）HILIC环境中，则可使用这些保留机制中的任意一种（则物质的保留可能是任何一种机制作用，也可能是所有机制同时作用）。

图3
潜在HILIC保留机制图示

极性分析物通常包含能够与其它极性基团相互作用的各种基团，如：固定相上的基团。极性相互作用包括氢键和偶极-偶极与其它基团的相互作用。带

电分析物也可以进行静电或离子交换式相互作用，其中分析物可以被固定相吸引或排斥。

例如，一个带负电的或酸性的分析物会被带负电的（即酸性的）固定相排斥。

但是，带正电的或碱性的分析物可被带负电的（酸性的）固定相保留，反之亦然。

ACE HILIC色谱柱固定相：

过去，许多HILIC固定相都采用非键合硅胶。

这些酸性相提供了必要的相（固定相必要的）极性，以在（使其能）HILIC模式中与高有机物含量洗脱剂很好地相互作用。

非键合硅胶相很有（好）用，所以仍在广泛使用。

Z近，在市场上已经可以买到专门用于HILIC环境的各种键合相（固定相）。

这些新的极性键合相根据相（固定相的）特性可分为很多种，包括酸性的、碱性的、中性的和新型的化学相。

ACE HILIC组合目前包括酸性的、中性的和碱性的固定相。

这些相已被证实可相互提供不同的选择性。
这些（三款）ACE相（固定相）彼此提供了替代选择性，可参见图4.九种组分混合物中的中性和带电分析物，在相同条件下，对三种不同的ACE HILIC相（在三款不同固定相的ACE HILIC色谱柱上）显现出不同的保留和洗脱顺序。

这清楚地表明：HILIC模式下各ACE HILIC固定相之间存在选择性差异，使得这三种色谱柱成为HILIC方法开发的理想选择。

图4
ACE HILIC固定相范围内洗脱顺序的对比
色谱柱：150 x 4.6 mm, 5 μm
流动相：10 mM甲酸铵，pH4.7（溶于MeCN/H2O中）（90:10 v/v）
流速：1.5 mL/min
温度：25 °C
检测：UV, 254 nm
样品：
1) 对氨基苯甲酸
2) 4-羟基苯甲酸
3) 烟酰胺
4) 醋丁洛尔
5) 腺嘌呤
6) 扁桃酸
7) 酪胺
8) 阿替洛尔
9) 2’-脱氧鸟苷

ACE HILIC-A相

ACE HILIC-A相能形成负电荷，并显示出高（强）阳离子交换能力。

带电的碱基（碱性物质）对ACE HILIC-A相进行（产生）静电吸引，而带电的酸性物质则被排斥。
ACE HILIC-A相的带电程度取决于流动相的pH值。

ACE HILIC范围的推荐pH限值为pH2.0到pH7.0。

通过增大pH值，固定相上的负电荷将变得更明显，从而保留更多的阳离子分析物。

ACE HILIC-N相

中性ACE HILIC-N相对阴阳离子都显示出较低的离子交换能力。

ACE HILIC-N相的保留机制包括极性相互作用、吸附和一定程度的分散（分配能力）。

ACE HILIC-B相

ACE HILIC-B相具有合理的阴离子交换能力，从而可保留酸性分析物，同时碱性分析物将被排斥。

与ACE HILIC-A相似，pH值可影响固定相的电荷，因此可减弱或增强该相的正特性（该相的正电荷特性）。

葛仙米属于蓝藻门念珠藻科，是一种具有较高经济价值的可食用蓝藻。葛仙米多糖是由葡萄糖、半乳糖和葡萄糖醛酸等多种单糖组成，具有抗肿瘤、抗凝血与抗 菌等作用。研究表明葛仙米多糖主要为大分子量多糖，且该多糖部分没有蛋白和核酸的吸收，可采用HPLC-RI方法进行定量分析。

本次分享的应用中，作者采用TSKgel G6000PWXL尺寸排阻色谱柱及示差折光检测器 (RI) 检测建立了一套高效液相色谱快速、准确直接测定葛仙米中大分子量多糖含量的方法。

01 分析条件

色谱柱：TSKgel G6000PWXL（7.8 mmI.D.×30 cm, 13 μm）

流动相：0.05 M 磷酸二氢钠+0.15 M硝酸钠（pH 7.0）

流速：0.5 mL/min

进样体积：100 μL

柱温：30 ℃

检测器：RI

02 测定方法

将经过预处理的葛仙米多糖提取液按标准溶液的测定条件测出峰面积。根据线性方程和以下公式算出葛仙米多糖的含量。多糖含量=D/M×100%，其中，D为根据线性方程算出葛仙米多糖的质量体积比（mg/mL），M是原料质量体积比（mg/mL）。

03 分析结果

图1  标准品和样品对比色谱图

图2  纯水和样品紫外280nm检测下对比谱图

04 结果与讨论

以醇沉的葛仙米多糖为标准品，在0.015625-5.0 mg/mL内，峰面积与进样量作标准曲线得到线性方程Y=1995695.548X-170.597，峰面积与样品浓度，线性关系良好（R2=0.999）,定量上限为10 mg/mL、下限为0.078625 mg/mL。

HPLC法测定葛仙米多糖与苯酚硫酸法相比，优势在于可以测定特定分子量范围的多糖。采用TSKgel G6000PWXL尺寸排阻色谱柱，能够在大分子多糖无蛋白和核酸干扰的情况下更加准确地进行定量。

参考资料：

1. 苏攀峰, 唐庆九, 陈盛 等. 高效液相色谱法测定葛仙米水溶性多糖含量. 上海农业学报. 2020, 36 (1):105-110

ACE HILIC法开发平台和工作实例

图17显示了HILIC方法开发的流程图。
一般方法是：收集分析物相关的信息（如果已知的话），针对三个ACE HILIC相（用三款不同的ACE HILIC色谱柱在不同的pH洗脱液条件下）执行梯度或等度HILIC筛选实验（取决于样本分析物的亲水性范围），然后再优化色谱法以达到可接受的HILIC法。
表1中列出了ACE HILIC筛选条件。

这些设计旨在探索广泛的选择性范围，以及为达到所需分离提供一个良好的起点。

图17
ACE HILIC 方法开发流程图

表1
ACE HILIC筛选实验的条件

ACE HILIC色谱柱保存方法

使用之后，ACE HILIC色谱柱应使用体积比为7:3的乙腈和水进行冲洗，清除掉所有的缓冲盐。

然后，使用的异丙醇、以更低的流速进行冲洗，以便贮存。应往回拧紧色谱柱端盖（拧紧色谱柱端盖），并将色谱柱放回盒内。

每次分析运行之后，除非第二天要使用，否则建议采用密闭法（按长期保存的方法）清洗色谱柱，然后用异丙醇冲洗。

实例1 – 咖啡茵和相关化合物

方法开发中所需的咖啡茵和四种相关化合物（可可碱、茶碱、次黄嘌呤和黄嘌呤）这些化合物都是极性的中性物质，其中负log P值表示合理的亲水性（log P为负值明确的表明其亲水性），因此适用于HILIC（图18）。

图18
咖啡茵和相关物质的结构和log P数据

咖啡茵和相关化合物在pH为3-6的情况下不可电离，因此洗脱剂的pH几乎不会直接影响分子。

为此，选择pH 3.0和4.7。

固定相会受洗脱剂pH变化的影响，这可能是有利的一面。

固定相的电离变化将影响粒子周围的水合层，这会影响分析物分散到相中（分配在固定相上）或形成氢键的程度。

因此，在pH3.0和pH4.7的情况下对三个固定相进行筛选，结果如图19中所示。
新的ACE HILIC色谱柱使用60倍柱体积相互平衡（平衡），以在粒子周围形成水合层。表1中显示了流动相、梯度和温度。
筛选结果显示：三个固定相与两个pH值之间观察到一些选择性差异（三个固定相在两个pH值下的筛选结果可以看出彼此间具有选择性的差异）。

基于筛选数据的Z有效分离是针对pH为3.0下的（pH为3.0下的）ACE HILIC-N相。

这些数据选择（选定这些条件）用于进一步优化。

图19
ACE HILIC色谱柱的梯度筛选

条件如表1中所述，275nm条件下的检测除外。进样25mg/mL的咖啡茵混合物2μL（使用pH3.0和pH4.7的甲酸铵，以0.5%w/w的比例混合相关物质和MeCN/H2O（90:10 v/v））
样本：
1) 咖啡茵

2) 茶碱
3) 可可碱
4) 黄嘌呤
5) 次黄嘌呤

较早洗脱峰的保留窗口（时间段）非常窄，这表示：等度HILIC可用于分离分析物。（等度方式的HILIC可以被用于分离这些化合物）10mM甲酸铵，pH3.0（溶于MeCN/H2O中）（94:6 v/v）被选为等度条件（图20）。

在这些条件下，峰4和5要保留得更多（好），但峰2和3仍未解析出（被分离）。
根据梯度运行的结果，乙腈含量更高似乎不会提高峰2和3的解析度（高的乙腈含量没有提高2与3峰的分离度），所以梯度HILIC分析得到改善（所以梯度分析是对混合物分离有更合适的，温度将被研究），从而开发出Z终方法，如图21所示。

图20
ACE HILIC-N相中咖啡茵和相关化合物的等度分析

ACE HILIC-N相中咖啡茵和相关化合物的等度分析
色谱柱：ACE 5 HILIC-N，
150 x 4.6 mm
流动相：10 mM甲酸铵，pH3.0（溶于MeCN/H2O中）（94:6 v/v）
流速：1.5 mL/min
温度：25 °C
检测：UV, 275 nm
进样：2 μL
样本：
1) 咖啡茵

2) 茶碱
3) 可可碱
4) 黄嘌呤
5) 次黄嘌呤

温度的降低会提高茶碱与可可碱之间的解析度（分离度），因此，Z终方法（图21）被认为适合其用途。

图21
Z终开发方法：

色谱柱：ACE 5 HILIC-N，150 x 4.6 mm
流动相：A = 10mM甲酸铵（pH3.0）溶于MeCN/H2O中（96:4 v/v）中 B = 10mM甲酸铵（pH3.0）溶于MeCN/H2O（1:1 v/v）中
梯度：0-B在15分钟内，B持续5分钟，下一次进样维持在起始条件20分钟
流速：1.5 mL/min
温度：15 °C
检测：275 nm
进样：2 μL

实例2 – 肌酸和肌酐

肌酸（图22）是使用甘氨酸和精氨酸合成的氨基酸。

它在为体内细胞提供能量方面起着重要作用（在体内主要用于为细胞供能），并形成（生成）副产品肌酐。测定血液中的肌酐，确定肾功能是否正常，其中肌酐水平的增加表示肾可能不会完全过滤废物。（升高表明肾的过滤废物的功能有所降低）

图22
结构和log P肌酸和肌酐数据

图23
使用pH为3.0、4.7和6.0的甲酸铵对ACE HILIC范围的等度筛选对比
样本：
1) 肌酐
2) 肌酸

在三种pH值条件下，利用等度条件对三个HILIC固定相的两种分析物进行筛选。

结果表明：肌酐在三个ACE HILIC相中被适当地保留，但由于过度保留的原因，肌酸在合理的时间内没有洗脱。

根据图17中的流程图，过度保留窗口表示梯度（宽时间段表明梯度方法）可能更适宜。

图24
ACE HILIC-A相下的Z终方法

ACE HILIC-A在pH3.0下选择，进行梯度分析。

标准梯度在10分钟内析出两种目标分析物，并且解析度很高（分离度很高）（数据未显示）。因此，这使得梯度时间进一步减少（这种情况下可以使梯度运行时间进一步减少），从而缩短了整体运行时间。

Z终方法如图24中所示。

色谱柱：150 x 4.6 mm, 5 μm
流动相：
A：2 mM甲酸铵（pH3.0）溶于MeCN/H2O（90:10 v/v）中
B: 2 mM甲酸铵（pH3.0）溶于MeCN/H2O（50:50 v/v）中
梯度：5-55%B，在10分钟内
流速：1.5 mL/min
检测：230 nm
进样：5 μL
样本：
1) 肌酐
2) 肌酸

结论

HILIC是一种用于多用途的极性分析物色谱分析法（对于极性化合物来说是一种通用的色谱分析模式）。

这种方法比较复杂，但如果遵循简单规则，则可实现可再现的HILIC方法（HILIC方法是可以重现性的）。

三个ACE HILIC相（固定相）设计用于HILIC方法开发期间研究选择性，并尽可能快地提供实现所需分离的选项。

ACE HILIC方法验证协议（规程）已成功用于开发一系列的HILIC方法，应为HILIC方法开发活动提供一种结构化的方法。

GX液相色谱柱是消耗品，会随着使用时间或进样次数的增加，出现柱效下降无法达到分离要求，或伴有峰型拖尾、分叉等情况。需要定期进行清洗和再生，以保证色谱柱的柱效和使用寿命。

不同类型的色谱柱都有与之对应的清洗方法。本文为大家介绍TSKgel SW系列硅胶尺寸排阻色谱柱的清洗方法。

根据样品性质，建议先从以下①和②中选择适当的清洗方法，每一步清洗之间用纯水冲洗。清洗色谱柱时的流速与溶剂替换流速一致。

1 去除离子性杂质

使用高盐浓度的流动相（例如：0.5M硫酸钠，pH3溶液）或酸性水溶液（例如：磷酸盐缓冲液，pH2.5）过柱清洗。

2 去除疏水性杂质

在清洗液中添加10-20%的甲醇、乙腈等水溶性有机溶剂过柱清洗。

如果采用上述两种方法清洗后色谱柱性能仍不能恢复，再考虑以下第③种方法。

3 去除难溶性蛋白质或其他物质

在清洗液中添加6-8mol/L的尿素或0.2-0.3%的中性表面活性剂（Triton、Tween、Brij等）后过柱清洗。但需要留意的是尿素或中性表面活性剂可能会残留在色谱柱上。

一般来说，清洗时间可选择为过柱5-10个柱体积便可。在吸附成分其吸附力极强时，即使进行过清洗，色谱柱性能也有可能得不到恢复。另外，请充分考虑清洗液的pH值，以避免损坏色谱柱。

概述

寡核苷酸是一类只有50个以下碱基的短链核苷酸的总称（包括脱氧核糖核酸DNA或核糖核酸RNA的核苷酸）。

近几年，随着寡核苷酸疗法在ZL各种疾病适应症方面取得了临床上显著的进展，已有多种寡核苷酸类药物，如小干扰RNA (siRNA) 和反义寡核苷酸 (ASO) 药物获得了FDA上市批准。另外还有多种microRNA (miRNA) 和适配体 (Aptamer) 正在研发中。因此，更大量、更高纯度的寡核苷酸产品的需求也随之日益增长。

东曹生命科学提供多种具有高分辨率、选择性的色谱柱和层析填料产品以满足从分析到纯化制备不同规模的应用需求。

寡核苷酸的HPLC分离模式

下表中列举了寡核苷酸HPLC分析的几种分离模式及适用的分离条件。也可以通过连用MS进行检测。

ZL性寡核苷酸是由固相化学合成法制成。在合成过程中会产生工艺相关杂质和产品相关杂质。产品相关杂质包含许多目标产物的类似物（分子量的差别：碱基数n-1、n、n+1等），磷酸基S化等的不对称化合物、异构体等。因此，杂质的分析监控对工艺和质量控制就显得十分重要。一般而言，通过阴离子交换色谱法即可实现这一分析需求。

寡核苷酸IEC-HPLC分析

下图是使用TSKgel DNA-STAT阳离子交换色谱柱分离具有不同序列的4种寡核苷酸引物 (单链) 。

在IEC分离模式中，如果使用无孔填料的色谱柱可以提高分辨率。此款色谱柱采用的是亲水性无孔树脂填料，粒径5μm，表面由开放型多层阴离子交换基团构成。这些特性与创新的化学键合方法相结合，使其载量更高、操作压力更低，非常适合于寡核苷酸的高分辨率分析。

寡核苷酸的纯度检测

在离子交换色谱柱中，可以对离子基团与主成分有一处不同的化合物进行分离，比如能够分离n-1、n、n+1的化合物。下图是TSKgel DNA-NPR阳离子交换色谱柱对13个碱基的硫代磷酸寡核苷酸粗样分析的色谱图。

TSKgel DNA-STAT色谱柱对粗制的寡核苷酸与纯化后的样品进行纯度评估。

寡核苷酸的分析要点

1、根据核酸样品的稳定性和大小来选择合适的洗脱液。如果核酸的稳定性很高，可以采用碱性溶液 (NaOH，pH12) 和高温60℃条件下分离，可提高分辨率。如果是稳定性差的，则推荐使用pH7-8的中性洗脱液，温度40℃条件下分离。

2、在样品吸附强的情况下，可使用比NaCl或NaBr洗脱能力更强的NaClO₄进行梯度分离。

3、如果样品是超巨大双链DNA (如质粒DNA)，使用TSKgel DEAE-NPR (4.6mm I.D.×3.5cm) 的话不仅可以获得高分辨率，而且回收率也会更好。

上篇文章《寡核苷酸类药物的HPLC分析 (一) TSKgel IEC色谱柱应用例》中我们提到了随着寡核苷酸药物的研发步伐越来越快，对高纯度寡核苷酸产品的需求也日趋旺盛。目前，寡核苷酸主要是通过化学合成法制成，在合成过程中会产生工艺相关杂质和产品相关杂质，离子交换液相色谱法是分析这些杂质的重要手段之一。此篇文章我们将介绍尺寸排阻色谱法在寡核苷酸药物质量控制中的应用。

在寡核苷酸的分析中，尺寸排阻分离模式是基于碱基数量、磷酸基不同导致的分子量差别进行分离，通常用于简单的质量控制或纯度研究。该模式的优点是可以使用接近生理条件的洗脱溶液进行等度分离。有时也会添加水溶性有机溶剂来YZ疏水吸附。

分析不同碱基数目的寡核苷酸

下图是采用两根串联的SEC色谱柱TSKgel UP-SW2000来区分长度相差一个碱基的寡核苷酸混合物 (20-mer和N-1 19-mer)。

TSKgel UP-SW2000是东曹生命科学ZX开发的粒径2μm、孔径12.5nm的硅胶基质SEC色谱柱，主要用于分离分子量范围为1-150kDa的小蛋白、肽和寡核苷酸等生物分子。该色谱柱兼容HPLC和UHPLC系统，因此也能够从传统的HPLC-SEC方法转换到UHPLC。

下图是使用TSKgel G2000SWXL色谱柱分离不同碱基数量的合成寡核苷酸混合物的谱图。为了YZ核酸酶活性，有时会在流动相中添加EDTA等约1 mmol/L的螯合剂。

SEC法分离脂质体包被的siRNA

下图是使用TSKgel SuperSW2000色谱柱对天然型DNA核酸药物Defitelio进行质量分析的示例。

参考文献：Handbook of analysis of oligonucleotides and related Products, Feb.23 (2011) 125, Edited by J.V. Bonilla et al.

寡核苷酸分析用SEC色谱柱

下表中列出了适用于核酸分离的SEC色谱柱。对于＜375 bp的短链核酸或寡核苷酸，UP-SW3000、UP-SW2000、G3000SWXL以及G2000SWXL这几款色谱柱都是比较推荐的。

CNW Athena Hilic RAC色谱柱是一款以高纯硅胶为基质的新型混合离子交换色谱柱。该色谱柱可以提供独特的反相、阴离子交换、阳离子交换等多重表面化学作用，为各种水溶性极性化合物等提供高效和高选择性的分离。Hilic RAC液相柱的典型应用有：三聚氰胺、氨基糖苷类化合物的测定等。

产品优势

① 低流失

② 键合相稳定

③ 基线稳定性优异

④ 可用于质谱分析

⑤ 适用于各种流动相：包括有机溶剂（如甲醇和乙腈）和各种缓冲盐（磷酸盐、乙酸铵、甲酸铵）的混合物

典型应用 

液相-质谱法检测16种氨基糖苷类化合物

（包含重 点管控新污染物“氨基糖苷类抗生素”）

新污染物是指新近发现或被关注，对生态环境或人体健康存在风险，尚未纳入管理或者现有管理措施不足以有效防控其风险的污染物。2022 年 12 月生态部发布首批“重 点管控新污染物清单”，其中抗生素类物质被列入清单。安谱实验使用新款HILIC RAC混合离子交换色谱柱，开发出针对氨基糖苷类抗生素的液相-质谱检测方法，实现了16种氨基糖苷的同时分析。话不多说，今天为大家带来16种氨基糖苷类化合物检测的液相-质谱整体解决方案，请查收~

色谱条件

a）色谱柱：HILIC RAC，2.1mm x 150mm, 5μm（PN: LAEQ-211599）

b）流动相：A 为乙腈，B 为 1%甲酸，梯度洗脱，洗脱程序见表 1

c）流速：0.3 mL/min

d）柱温：30 ℃

e）进样量：20 µL

f）标准品：100ppb

质谱条件

a. 离子源：ESI

b. 扫描方式：正离子模式

c. 检测方式：MRM

d. 雾化气：240 KPa

e. 电离电压：5000 V
f.  离子源温度：300 ℃
g. 干燥气：100 KPa

实验谱图

图1、16 种氨基糖苷类药物标准物质总离子流色谱图

图2、16 种氨基糖苷类标准品定量离子对和定性离子对的多反应监测（MRM）色谱图

实验结论

采用 HILIC 混合型离子交换色谱柱 Hilic RAC 2.1mm x 150mm, 5μm（PN:LAEQ-211599），可以实现 16 种氨基糖苷同时分析。

注意事项

01 氨基糖苷类标准品稳定性不好，建议标准溶液现用现配；

02 氨基糖苷类标准品在玻璃材质上会有吸附，且需避光，建议整个前处理过程避免使用玻璃材质器具，进样小瓶推荐 2mL 棕色聚丙烯材质(PN: VAAP-32009P-1232A-100)；

03  HILIC 分离模式和反相分离模式不同，稀释溶剂水相比例高于初始流动相中水相比例时，会有溶剂效应，所有氨基糖苷目标物会出峰太早，建议稀释溶剂用乙腈。

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