HILIC色谱柱的分离机制

HILIC分离机制

HILIC是一种复杂的分离技术，通过多种相互作用模式来实现保留。

这些相互作用的权重（中哪种是主要作用）是基于固定相、流动相和分析物的理化特性。

为了得到可靠和稳健的HILIC方法，了解潜在的不同相互作用（了解可能存在的不同相互作用）是很有帮助的。

这样可以为待进行的方法开发合理选择色谱柱和条件。（这样可以为方法开发的色谱柱和条件做出合理的选择）
HILIC中的流动相通常包含大量的乙腈（>70%）以及至少3%的水。

水性组分使得极性固定相周围存在亲水环境，并且形成吸附水层以便分析物分散（分配）。

主要的HILIC保留机制包括：
分析物分散（分配）到吸附水层，各种极性相互作用和静电（即离子交换式）相互作用（参见图3）。

如果将极性分析物通入（极性分析物进入）HILIC环境中，则可使用这些保留机制中的任意一种（则物质的保留可能是任何一种机制作用，也可能是所有机制同时作用）。

图3
潜在HILIC保留机制图示

极性分析物通常包含能够与其它极性基团相互作用的各种基团，如：固定相上的基团。极性相互作用包括氢键和偶极-偶极与其它基团的相互作用。带

电分析物也可以进行静电或离子交换式相互作用，其中分析物可以被固定相吸引或排斥。

例如，一个带负电的或酸性的分析物会被带负电的（即酸性的）固定相排斥。

但是，带正电的或碱性的分析物可被带负电的（酸性的）固定相保留，反之亦然。

ACE HILIC色谱柱固定相：

过去，许多HILIC固定相都采用非键合硅胶。

这些酸性相提供了必要的相（固定相必要的）极性，以在（使其能）HILIC模式中与高有机物含量洗脱剂很好地相互作用。

非键合硅胶相很有（好）用，所以仍在广泛使用。

Z近，在市场上已经可以买到专门用于HILIC环境的各种键合相（固定相）。

这些新的极性键合相根据相（固定相的）特性可分为很多种，包括酸性的、碱性的、中性的和新型的化学相。

ACE HILIC组合目前包括酸性的、中性的和碱性的固定相。

这些相已被证实可相互提供不同的选择性。
这些（三款）ACE相（固定相）彼此提供了替代选择性，可参见图4.九种组分混合物中的中性和带电分析物，在相同条件下，对三种不同的ACE HILIC相（在三款不同固定相的ACE HILIC色谱柱上）显现出不同的保留和洗脱顺序。

这清楚地表明：HILIC模式下各ACE HILIC固定相之间存在选择性差异，使得这三种色谱柱成为HILIC方法开发的理想选择。

图4
ACE HILIC固定相范围内洗脱顺序的对比
色谱柱：150 x 4.6 mm, 5 μm
流动相：10 mM甲酸铵，pH4.7（溶于MeCN/H2O中）（90:10 v/v）
流速：1.5 mL/min
温度：25 °C
检测：UV, 254 nm
样品：
1) 对氨基苯甲酸
2) 4-羟基苯甲酸
3) 烟酰胺
4) 醋丁洛尔
5) 腺嘌呤
6) 扁桃酸
7) 酪胺
8) 阿替洛尔
9) 2’-脱氧鸟苷

ACE HILIC-A相

ACE HILIC-A相能形成负电荷，并显示出高（强）阳离子交换能力。

带电的碱基（碱性物质）对ACE HILIC-A相进行（产生）静电吸引，而带电的酸性物质则被排斥。
ACE HILIC-A相的带电程度取决于流动相的pH值。

ACE HILIC范围的推荐pH限值为pH2.0到pH7.0。

通过增大pH值，固定相上的负电荷将变得更明显，从而保留更多的阳离子分析物。

ACE HILIC-N相

中性ACE HILIC-N相对阴阳离子都显示出较低的离子交换能力。

ACE HILIC-N相的保留机制包括极性相互作用、吸附和一定程度的分散（分配能力）。

ACE HILIC-B相

ACE HILIC-B相具有合理的阴离子交换能力，从而可保留酸性分析物，同时碱性分析物将被排斥。

与ACE HILIC-A相似，pH值可影响固定相的电荷，因此可减弱或增强该相的正特性（该相的正电荷特性）。

ACE HILIC色谱柱检测器兼容性

HILIC是一种能很好兼容众多主流检测器的技术。因此，检测的（检测器的）选择受检测器可用性、所需的检测限制和分析物的理化特性（即：具有发色团或电荷）等综合因素的影响。

UV-Vis检测器

UV-Vis检测器是分析试验室中Z常见的检测器之一。

根据仪器的不同，一次可记录多个波长，以优化分析物覆盖范围。

有时，混合物中的分析物可通过参考紫外光谱库来快速识别。

图10中的例子示出了五种β受体阻滞剂的分离，这些阻滞剂可通过他们不同的图谱清楚识别（识别清楚）。

图10
五种β受体阻滞剂的色谱图和紫外光谱
色谱柱：ACE 5 HILIC-N，150 x 4.6 mm
流动相：10 mM甲酸铵pH3.0（溶于MeCN/H2O中）（90:10 v/v）
流速：1.5 mL/min
温度：25 °C
检测：UV, 214 nm
样本：
1) 普萘洛尔
2) 醋丁洛尔
3) 索他洛尔
4) 沙丁胺醇
5) 阿替洛尔

折射率检测器

示差折光测器（RID）测量当通过检测器时分析物峰相对参考溶剂（即流动相）的折射率。如果这二者之间存在差别，色谱图中可观察到峰。

RID对缺乏活性发色团的分析物很有用，尤其常用于糖分分析。
RID存在几个方面的劣势。这些劣势包括灵敏度受限和没有峰相关的信息（峰的身份通常需要单独的标准来验证）。

此外，RID只能用于等度条件，因为洗脱剂（洗脱剂组成变化）会改变折射率响应。

作为物理测量，折射率也很受温度的影响，也就是说，基线噪声和再现（重现）性会发生变化。

蒸发光散射检测器

蒸发光散射检测器（ELSD）通过如下方式工作：从LC上喷射输出洗脱液与惰性气体（通常为氮气），以形成液滴在加热室内去溶剂化。

去溶剂化后的分析物被分散的光源击中，然后进行检测（喷射出惰性气体来雾化从LC中输出的洗脱液，形成液滴后在加热管中蒸发，去溶剂的分析物被分散的光源击中然后进行检测）。

探测器（ELSD）需要挥发性洗脱剂，以使HILIC非常适合（HILIC方法就非常适合这款检测器）。ELSD是RID有效的替代选择，因为它非常适合非（无）发色团分析物，灵敏度更高，并且适用于梯度色谱法。

但是，ELSD不提供光谱信息，因此在没有标准的情况下，较难识别峰值（峰的识别很困难）。
对于HILIC分离（分析物），ELSD对发色团有限（有限发色团）的极性分析物更有利，例如甲基丙二酸（MMA）和琥珀酸（图11）。

MMA用作维生素B12缺乏症的生物标志，但琥珀酸与MMA等压（元素相同），因此必须彻底解决以防止假阳性结果。

采用ELSD的HILIC法，其MMA量化比紫外线检测法更好。

图11
甲基丙二酸和琥珀酸的色谱图
色谱柱：ACE 5 HILIC-B,
150 x 4.6 mm
流动相：10 mM
甲酸铵pH3.0（溶于MeCN/H2O中）（90:10 v/v）
流速：1.5 mL/min
温度：25 °C
检测：ELSD
样本：
1) 琥珀酸
2) MMA

质谱仪

质谱仪（MS）是LC分离中信息Z丰富的检测技术。

LC的洗脱剂流通常使用惰性气体（如氮气）去溶剂化（LC流出的洗脱液在加热管中被惰性气体去溶剂化），并在检测前电离。

可使用不同的质谱分析仪，如：四极质谱仪、飞行时间质谱仪、离子阱质谱仪等。有机物含量较高的HILIC洗脱剂特别适合MS检测。

有多个电离源可用，根据具体应用进行选择。

喷雾电离质谱（ESI）很常用，但也使用电晕放电和光电离源。MS具有高度专一性，因为可利用选择性离子检测（SIM）进行跟踪（因为可以使用选择离子性监测来跟踪单个物质的荷质比（m/z），得到更好的选择性），提高灵敏度。MS还可以在不同质量范围内执行扫描，这对未知的样本（样品）很有帮助。

但是，MS扫描通常灵敏度小得多。（具有更小的灵敏度。）

MS可用于检测发色团较弱或者没有发色团的分析物。

作为一种识别工具，MS对HILIC应用也很有帮助，这种应用中分析物具有相似的紫外光谱特性，但质量不同（在HILIC应用中，当分析物具有相似的紫外光谱特性，但质量不同，MS是很有用的识别工具）。

核酸碱基和核苷就是一个很好的HILIC例子。极性分析物腺嘌呤、腺苷和2’-脱氧腺苷的紫外光谱非常相似（图12）。

图12
腺嘌呤、腺苷和2’-脱氧腺苷的紫外光谱对比
蓝色轨迹：腺嘌呤
红色轨迹：腺苷
绿色轨迹：2’-脱氧腺苷
色谱柱：ACE 5 HILIC-N，150 x 4.6 mm
流动相：10 mM甲酸铵，pH4.7（溶于MeCN/H2O中）（90:10 v/v）
流速：1.5 mL/min
温度：25 °C
检测：UV
进样量：2 μL

MS可利用这些分析物不同的质荷比进行检测和识别峰（图13）。SIM用于提高灵敏度。

图13
利用UV和MS联合检测法分析ACE HILIC-N的腺嘌呤和核苷
（a）下列物质的紫外光色谱图：
1) 2’-脱氧腺苷（m/z 252.4）
2) 腺嘌呤（m/z 136.1）
3) 腺苷（m/z 268.3）
(b) 通过MS SIM确认峰
色谱柱：ACE 5 HILIC-N，150 x 4.6 mm
流动相：10 mM甲酸铵，pH4.7（溶于MeCN/H2O中）（90:10 v/v）
流速：1.5 mL/min
温度：25 °C
检测：UV，254nm和MS

PFP分离机制
ACE C18-PFP相显示有多个保留机制，包括疏水性、π-π相互作用、偶极-偶极、氢键和形状选择性。

虽然下述部分提供了相对强度的近似值，但每个保留机制的优势由溶质的物理/化学性质、其结构和所采用的色谱条件决定。

π-π相互作用

PFP环在相的表面上加入了芳香特性。

然而，PFP相不同于苯基相，因为电负性氟原子会产生缺电子的苯环，使得PFP相可以作为路易斯酸而起作用。

这将与能够给出电子的分析物（即路易斯碱）相互作用。
这与苯基相相反，苯基相含有富电子芳香环（由于不存在吸电子基团），因此它们可以作为路易斯碱而起作用。

偶极-偶极和氢键

PFP环中的碳-氟键具有强极性。

因此，PFP相可以通过在分析物与电负性氟原子之间发生的偶极-偶极或氢键相互作用来额外保留分析物。

任何这样的相互作用将导致保留增加。

形状选择性

PFP具有刚性环结构，当与其它可能的保持机制相结合时，可以赋予PFP相优异的形状选择性。

ACE C18-PFP相显示有PFP相的多重保留机制，色谱科学家们可能会利用这些机制来解决在传统C18相（仅主要依赖于疏水保留机制）上难以分离（即使并非不可能）的混合物。

ACE HILIC法开发平台和工作实例

图17显示了HILIC方法开发的流程图。
一般方法是：收集分析物相关的信息（如果已知的话），针对三个ACE HILIC相（用三款不同的ACE HILIC色谱柱在不同的pH洗脱液条件下）执行梯度或等度HILIC筛选实验（取决于样本分析物的亲水性范围），然后再优化色谱法以达到可接受的HILIC法。
表1中列出了ACE HILIC筛选条件。

这些设计旨在探索广泛的选择性范围，以及为达到所需分离提供一个良好的起点。

图17
ACE HILIC 方法开发流程图

表1
ACE HILIC筛选实验的条件

ACE HILIC色谱柱保存方法

使用之后，ACE HILIC色谱柱应使用体积比为7:3的乙腈和水进行冲洗，清除掉所有的缓冲盐。

然后，使用的异丙醇、以更低的流速进行冲洗，以便贮存。应往回拧紧色谱柱端盖（拧紧色谱柱端盖），并将色谱柱放回盒内。

每次分析运行之后，除非第二天要使用，否则建议采用密闭法（按长期保存的方法）清洗色谱柱，然后用异丙醇冲洗。

实例1 – 咖啡茵和相关化合物

方法开发中所需的咖啡茵和四种相关化合物（可可碱、茶碱、次黄嘌呤和黄嘌呤）这些化合物都是极性的中性物质，其中负log P值表示合理的亲水性（log P为负值明确的表明其亲水性），因此适用于HILIC（图18）。

图18
咖啡茵和相关物质的结构和log P数据

咖啡茵和相关化合物在pH为3-6的情况下不可电离，因此洗脱剂的pH几乎不会直接影响分子。

为此，选择pH 3.0和4.7。

固定相会受洗脱剂pH变化的影响，这可能是有利的一面。

固定相的电离变化将影响粒子周围的水合层，这会影响分析物分散到相中（分配在固定相上）或形成氢键的程度。

因此，在pH3.0和pH4.7的情况下对三个固定相进行筛选，结果如图19中所示。
新的ACE HILIC色谱柱使用60倍柱体积相互平衡（平衡），以在粒子周围形成水合层。表1中显示了流动相、梯度和温度。
筛选结果显示：三个固定相与两个pH值之间观察到一些选择性差异（三个固定相在两个pH值下的筛选结果可以看出彼此间具有选择性的差异）。

基于筛选数据的Z有效分离是针对pH为3.0下的（pH为3.0下的）ACE HILIC-N相。

这些数据选择（选定这些条件）用于进一步优化。

图19
ACE HILIC色谱柱的梯度筛选

条件如表1中所述，275nm条件下的检测除外。进样25mg/mL的咖啡茵混合物2μL（使用pH3.0和pH4.7的甲酸铵，以0.5%w/w的比例混合相关物质和MeCN/H2O（90:10 v/v））
样本：
1) 咖啡茵

2) 茶碱
3) 可可碱
4) 黄嘌呤
5) 次黄嘌呤

较早洗脱峰的保留窗口（时间段）非常窄，这表示：等度HILIC可用于分离分析物。（等度方式的HILIC可以被用于分离这些化合物）10mM甲酸铵，pH3.0（溶于MeCN/H2O中）（94:6 v/v）被选为等度条件（图20）。

在这些条件下，峰4和5要保留得更多（好），但峰2和3仍未解析出（被分离）。
根据梯度运行的结果，乙腈含量更高似乎不会提高峰2和3的解析度（高的乙腈含量没有提高2与3峰的分离度），所以梯度HILIC分析得到改善（所以梯度分析是对混合物分离有更合适的，温度将被研究），从而开发出Z终方法，如图21所示。

图20
ACE HILIC-N相中咖啡茵和相关化合物的等度分析

ACE HILIC-N相中咖啡茵和相关化合物的等度分析
色谱柱：ACE 5 HILIC-N，
150 x 4.6 mm
流动相：10 mM甲酸铵，pH3.0（溶于MeCN/H2O中）（94:6 v/v）
流速：1.5 mL/min
温度：25 °C
检测：UV, 275 nm
进样：2 μL
样本：
1) 咖啡茵

2) 茶碱
3) 可可碱
4) 黄嘌呤
5) 次黄嘌呤

温度的降低会提高茶碱与可可碱之间的解析度（分离度），因此，Z终方法（图21）被认为适合其用途。

图21
Z终开发方法：

色谱柱：ACE 5 HILIC-N，150 x 4.6 mm
流动相：A = 10mM甲酸铵（pH3.0）溶于MeCN/H2O中（96:4 v/v）中 B = 10mM甲酸铵（pH3.0）溶于MeCN/H2O（1:1 v/v）中
梯度：0-B在15分钟内，B持续5分钟，下一次进样维持在起始条件20分钟
流速：1.5 mL/min
温度：15 °C
检测：275 nm
进样：2 μL

实例2 – 肌酸和肌酐

肌酸（图22）是使用甘氨酸和精氨酸合成的氨基酸。

它在为体内细胞提供能量方面起着重要作用（在体内主要用于为细胞供能），并形成（生成）副产品肌酐。测定血液中的肌酐，确定肾功能是否正常，其中肌酐水平的增加表示肾可能不会完全过滤废物。（升高表明肾的过滤废物的功能有所降低）

图22
结构和log P肌酸和肌酐数据

图23
使用pH为3.0、4.7和6.0的甲酸铵对ACE HILIC范围的等度筛选对比
样本：
1) 肌酐
2) 肌酸

在三种pH值条件下，利用等度条件对三个HILIC固定相的两种分析物进行筛选。

结果表明：肌酐在三个ACE HILIC相中被适当地保留，但由于过度保留的原因，肌酸在合理的时间内没有洗脱。

根据图17中的流程图，过度保留窗口表示梯度（宽时间段表明梯度方法）可能更适宜。

图24
ACE HILIC-A相下的Z终方法

ACE HILIC-A在pH3.0下选择，进行梯度分析。

标准梯度在10分钟内析出两种目标分析物，并且解析度很高（分离度很高）（数据未显示）。因此，这使得梯度时间进一步减少（这种情况下可以使梯度运行时间进一步减少），从而缩短了整体运行时间。

Z终方法如图24中所示。

色谱柱：150 x 4.6 mm, 5 μm
流动相：
A：2 mM甲酸铵（pH3.0）溶于MeCN/H2O（90:10 v/v）中
B: 2 mM甲酸铵（pH3.0）溶于MeCN/H2O（50:50 v/v）中
梯度：5-55%B，在10分钟内
流速：1.5 mL/min
检测：230 nm
进样：5 μL
样本：
1) 肌酐
2) 肌酸

结论

HILIC是一种用于多用途的极性分析物色谱分析法（对于极性化合物来说是一种通用的色谱分析模式）。

这种方法比较复杂，但如果遵循简单规则，则可实现可再现的HILIC方法（HILIC方法是可以重现性的）。

三个ACE HILIC相（固定相）设计用于HILIC方法开发期间研究选择性，并尽可能快地提供实现所需分离的选项。

ACE HILIC方法验证协议（规程）已成功用于开发一系列的HILIC方法，应为HILIC方法开发活动提供一种结构化的方法。

甜菜碱（Betaine）是一种生物碱，天然存在于很多动植物体内。其分子内有3个有效甲基，作为甲基提供者参与合成蛋氨酸，在营养物质的代谢中起着十分重要的作用。甜菜碱在医药、化妆品、食品发酵和饲料工业等多个行业中都有广泛的应用。

本应用参照行业标准NY/T 2947-2016，按GX液相色谱法，采用亲水作用多孔硅胶色谱柱TSKgel Amide-80 (3 μm, 4.6 mm I.D. × 15 cm) 来测定甜菜碱的含量。分析结果表明，该色谱柱完全满足标准中对甜菜碱分离检测的要求。

溶液配制

样品稀释液：75% 乙腈-水溶液。

用样品稀释液将甜菜碱储备液 (2 mg/mL) 序列稀释得到浓度为0 μg/mL，20 μg/mL，50 μg/mL，100 μg/mL，200 μg/mL，500 μg/mL，1000 μg/mL，2000 μg/mL的标准工作液，依次由低到高进样检测。

分析条件

色谱柱：TSKgel Amide-80 (3μm, 4.6mmI.D. ×15cm)

流动相：乙腈-水，梯度洗脱

流速：1.0 mL/min

柱温：30℃

紫外检测器：205 nm

进样量：10 μL

流动相梯度洗脱程序见下表：

分析结果

图1.  甜菜碱2000 μg/mL检测图谱

图2.  甜菜碱标准曲线（标准方差=0.99997）

利用ACE键合相的固定相选择

分离度方程式可以确定影响分离度的参数：柱效（N）、容量因子（k）和选择性（α）。

在过去几年里，柱效和使用超GX色谱柱（被称为“UHPLC”色谱柱）作为实现分离目标的手段已得到了极大的重视。

UHPLC已通过更快速的分离和更快速的方法开发提高实验室生产力来证明了其价值。

然而，选择性往往被忽视，且其重要性也被强调柱效所掩盖。这是令人遗憾的。

在影响分离度的三个参数中，选择性是Z为重要的。

（参见图1）通过利用柱效和选择性，通常可以实现更好和更快的分离。

图 1：N、α和k对分离度（Rs）的影响

提高N，α或k可以提高分离度（Rs）。

然而，从这些图中可以看出，随着N或k值的提高，对分离度的改善效果也逐渐降低。

另一方面，提高选择性（α）则没有这个问题，因此其成为开发分离方法时的Z佳优化变量。

在反相色谱中，固定相与分析物之间存在多种相互作用的机制，这可以用来实现分离。

这些相互作用机制包括：疏水性结合、π-π、氢键、偶极-偶极和形状选择性。

不同类型的键合相将提供其中一种或多种相互作用机制。表1列出了ACE键合相和每种可能的主要相互作用机制，这取决于分析物和流动相条件。

表1: 比较不同键合相的分离机制/相互作用                                                                                    

利用键合相的选择性实现更好的分离。
图2表明了两种ACE键合相即C18-AR与苯基之间的选择性差异。
尽管两种键合相提供了强π-π和偶极-偶极相互作用的可能性，但是在其它可能的相互作用机制（特别是疏水性结合）的强度方面，它们存在显著差异。

C18-AR可能具有其它不同的分离机制，可以为复杂的混合物带来更好的分离效果。对于其他混合物，可能不是这种情况，这是ACE键合相的优势。

当开发分离方法时，ACE键合相可以提供各种可供选择的重要保留机制。

非常强大且独特的C18-AR和C18-PFP相只有在ACE和ACE Excel色谱柱中可以获得。
通过利用柱效和选择性，可以实现更好的分离。

图 2：C18-AR与苯基相之间选择性差异的比较

色谱柱尺寸： 50 x 2.1 mm, 3 μm
流动相：

A= 20mM KH2PO4,pH 2.7（溶于水中）；
B= 20mM KH2PO4,pH 2.7（溶于甲醇/水中：65:35, v/v）
流速： 0.6 mL/min
温度： 60 ℃
检测： UV 214 nm
梯度： 5分钟内从3至B，并持续1分钟。

样品：
1. 甲硝唑
2. 3-羟基苯甲酸
3. 苯酚
4. 苯甲醇
5. 咖啡茵
6. 水杨酸
7. 喹喔啉
8. 苯甲酸
9. 奎宁
10. 非那西丁
11. 1,4-二硝基苯
12. 1,3,5-三硝基苯
13. 呋塞米
14. 1,3,5 -三甲氧基苯
15. 吡罗昔康
16. 卡维地洛
17. 苯甲酸乙酯
18. 去甲替林

C18-AR相的疏水性更大，这可以为色谱峰对（13,14）和（15,17）提供更多的保留值和更佳的选择性。还要注意C18-AR与苯基相的洗脱顺序有很多变化。

图3给出了键合相选择能力的另一实例。

一个分离是用C18键合相的UHPLC色谱柱完成，另一个分离是用C18-PFP键合相的UHPLC色谱柱完成。

C18-PFP键合相提供的额外分离机制，使得总体分离效果更佳出色。

图 3：ACE Excel可以获得zhuo越的分离度和峰形：药物及其相关物质的UHPLC结果

条件
色谱柱尺寸：50 x 2.1mm
流动相：

A = 5mM甲酸（溶于水中）
B = 5mM甲酸（溶于甲醇中）
梯度：5分钟内从3至B
流速：0.6 mL/min
温度：40 ℃
检测：UV 254 nm

样品
1. 对乙酰氨基酚
2. 氢氯噻嗪
3. 甲基苯基亚砜
4. 甲基苯砜

在C18 UHPLC色谱柱和C18-PFP色谱柱上同样快速地产生色谱图。

然而，C18-PFP色谱柱可以为色谱峰对（13,14）和（15,17）提供更佳的选择性，因此能够提供优越的总体分离性能。

具有独特选择性的C18 键合相：
1.有保证的可重现性
2.的键合相稳定性
3.疏水和五氟苯基“混合模式”的相互作用

改善色谱分离度
色谱分离的目标是在Z短的时间内获得目标组分的足够分离度（Rs）。

1.5的分离度可以实现基线分离，然而对于可以在实验室之间易于转换的耐用、可重法而言，理想的分离度是1.8-2.0。
分离度方程告诉我们什么变量可以影响分离度：

增加分离度Rs可以通过增加N、α或k来实现。

然而，如图1所示，可以看出，增加N或k以改善Rs的回报率快速下降。

例如，Rs仅随着N平方根的增加而增加。

可以通过增加柱长或降低柱填充材料的粒径或两者的某种组合来增加N。

无论哪种方式，系统背压随着N的增加而增加，因此通过增加N实现令人满意的分离，其“成本”可能是极高的压力。
同样，增加保留值（k值）将会增加Rs，但回报率也快速下降。

将k增加至超过10通常是Rs与分析时间之间的不利权衡，因为只有Rs的边际收益随着保留时间的增加而实现。

该效应的图形表示参见下述图1。

图1 N、α和k对分离度(Rs)的影响
对于典型的分离，其中：N = 10,000, k = 4, α= 1.1

增加N、α或k可以提高分离度(Rs)。

然而，从这些图中可以看出，N或k的提高都会迅速降低回报率。
另一方面，提高选择性（α）则没有这个问题，因此其成为开发分离方法时的Z佳优化变量。

增加α可以增加Rs，但不同于N和k,不会受回报率下降的约束。

α的变化对压力没有影响，对分离时间的影响也是微乎其微的（参见图2）。

因此，在开发分离方法时，α是Z重要的变数。

优化α可以使您在所有目标峰之间达到满意的分离度，同时保持系统背压和分离时间在可接受范围内。

改善色谱分离度- 选择性或柱效？
选择性(α)由流动相、温度和固定相化学物质控制。大多数方法开发策略将探索所有这些色谱变量。
如果使用“标准”3μm C18相没有达到足够的分离度，推荐优化分离的色谱选择性而不是分离柱效，如下述实例所示。
通过简单地将固定相化学物质（即色谱柱）改变为具有替代色谱选择性的固定相化学物质，易于在标准HPLC系统上获得所需分离度，而无需昂贵的UHPLC仪器。

另外，也可以避免复杂的流动相组分、升高的温度和侵蚀性pH条件。

图2利用选择性实现快速、高分离度的分离

样品：1）对乙酰氨基酚2）氢氯噻嗪3）甲基苯基亚砜4）甲基苯基砜5）阿司匹林6）非那西丁7）1,3-二硝基苯
8）1,2,4-三甲氧基苯9）苯甲酸乙酯10）尼美舒利11）布洛芬12）吲哚美辛13）甲芬那酸
色谱柱尺寸：50 x 2.1 mm 流速：0.60 ml/min 温度：40°C 检测：UV, 254 nm 流动相：A = 5 mM甲酸（溶于水中）以及B = 5 mM（溶于甲醇中），梯度= 在5分钟内3- B
比较数据不代表所有应用。

在保持C18键合相的同时，将粒径从3μm减小至2μm以下，并不能显著改善分离效果，另外也会导致压力明显增加。
ACE C18-PFP色谱柱为3个关键对提供了更佳的选择性(α)，因此与2μm以下的C18色谱柱相比，其可以提供的分离效果，即使2μm以下的色谱柱可以提供更高的柱效。
与使用具有高塔板数和高压的色谱柱尝试进行峰分离所获得的结果相比，利用选择性的能力可以获得更佳的分离效果。

HILIC流动相

HILIC模式中用作流动相的溶剂类似于RPLC模式下所用的溶剂。

流动相条件是各种HILIC保留机制的关键因素。

通过改变洗脱液中有机组分和水组分的比例，可以改变分析的保留率。

在HILIC模式下，保留因子建议保持在1.5-10之间。

有机改性剂

HILIC中Z常用的有机改性剂是非质子溶剂乙腈。

乙腈作为较弱的洗脱溶剂与水结合使用（见图5）。

与RPLC不同，增加流动相中的有机物含量百分比，可增大分析物的保留率。

乙腈具有粘度（粘度低）和紫外线切断（截止波长）较低等优点。

由于能够干扰固定相周围的水层，所以散装（主体）溶剂中通常要避免甲醇等质子溶剂。

这些溶剂可以形成氢键，从而破坏分析物分散（分配能力）。
但是，也存在极性溶剂（如甲醇和2-异丙醇（IPA））与水性部分结合使用以影响分离选择性的各种情况。

如果所有其它参数不能实现足够的分离[6]，这通常作为Z后的方法来使用。

洗脱剂pH值

洗脱剂的pH值对于方法开发来说是一个有用的参数。

如果pH值高于或低于可电离物质的pKa，则分析物的电离状态会发生改变，反过来会影响它的亲水性。

因此，这会影响（影响可电离分析物）与固定相的潜在相互作用，并且还会影响保留。

此外，pH值也会影响固定相表面的极性，进而影响到保留机制。
了解分析物的pKa非常有助于pH选择。若可能的话，建议与pKa相差2个pH单位，以达到特定的方法稳定性。对于酸性物质，低于pKa将使分析物主要以非电离状态存在。

在酸性分析物pKa的2个pH单位以上将使大部分分析物电离。对于碱性物质，正好相反。
为了进行方法开发，建议对（在）三种不同pH值条件下各种（用三款）ACE HILIC色谱柱的（对）混合分析物进行评估：
pH 3.0、4.7和6.0。这种方法探索了不同洗脱剂pH值条件下使用不同固定相时的选择性差异，而且经证明对HILIC方法开发是有效的。

例如，ACE HILIC-A相中，在pH为3.0、4.7和6.0的等度条件下，分析了包含酸性物质和中性物质的混合物（见图6）。所有其它条件都相同。

保留和洗脱顺序的差异（即选择性差异）可清楚地看出，这一单个HILIC相的pH值不同。

图6
ACE HILIC-A相中，不同流动相pH值下六种极性分析物的分析中性物-绿色酸-红色
色谱柱：150 x 4.6 mm, 5 μm
流动相：10 mM甲酸铵（溶于MeCN/H2O中）（90:10 v/v）
流速：1.5 mL/min
检测：UV, 254 nm
温度：25 °C
进样：5 μL
样本：
1) 4-氨基苯甲酸
2) 4-羟基苯甲酸
3) 烟酰胺
4) 扁桃酸
5) 腺嘌呤
6) 2’-脱氧鸟苷

缓冲液浓度

HILIC中可使用各种缓冲盐，但缓冲盐必须可溶解于高有机物含量的（含有高比例有机物的）洗脱剂中。

这就排除了像磷酸盐这样的无机缓冲盐。

甲酸铵缓冲盐比较适宜，因为它们在低pH范围内具有缓冲能力，并在高乙腈含量的洗脱剂中具有良好的溶解性。

HILIC的缓冲液浓度范围通常为2-18mM。
缓冲液浓度对保留率和选择性的影响取决于分析物和固定相的特性。

例如，图7显示了pH为3.0时，通过ACE HILIC-A固定相，甲酸铵缓冲液的浓度对三（三种）组分（极性的酸性、碱性和中性分析物）混合物分析物保留率（保留）的影响。

洗脱剂浓度低（洗脱剂的低pH）意味着：酸吡哆醛（峰1）以离子YZ或中性的形式存在。胞啶（峰2）是一种极性的中性分析物。

普鲁卡因胺（峰3）是一种带电的极性碱。在ACE HILIC-A相的这些条件下，极性碱的保留率显著下降，而（随着）缓冲液浓度增大（随着缓冲液浓度增大，极性碱的保留率显著下降）。

极性碱很可能主要是通过与带电酸性固定相进行离子交换的方式来保留。

缓冲强度的增加会使（与）碱性分析物形成竞争，并且保留率随后会因离子交换机制的耗尽而减小。

图7
缓冲液强度对分析物保留率的影响
色谱柱：ACE 5 HILIC-A,150 x 4.6 mm
流动相：甲酸铵，pH3.0（溶于MeCN/H2O中）（90:10 v/v）
流速：1.5 mL/min
检测：UV, 254 nm
温度：25 °C
进样：5 μL
样本：
1) 吡哆醛
2) 胞啶
3) 普鲁卡因胺

样品稀释液

HILIC模式下，由于分析物溶解性以及稀释液与HILIC洗脱剂不匹配等问题，通常较难选择合适的样本（样品）稀释液。

选择优化不足的稀释液会大大降低色谱性能和峰形。

通常，样本稀释液对各种分析物的影响不一样，并且这种行为因固定相的选择和洗脱剂的条件而存在差异。

因此，对样本稀释液的优化往往是针对特定应用的研究。
一般来说，建议增量为20%，缓冲比介于20%到80%之间（建议20%的乙腈增量让其处于缓冲比20%-80%之间来探索样品稀释方法）。

例如，图8（第16页）显示了pH为3.0时，三个ACE HILIC相中的每一个相（固定相）上酸性、碱性和中性分析物的峰形，其中研究了样本（在这三个固定相上的研究样品）稀释液乙腈（MeCN）的百分比。
通常，次黄嘌呤（极性中性）的峰形会随着所有ACE HILIC相有机浓度的增大而改善。

然而，分析物未能在的乙腈中溶解。

这种分析物Z有效的样本（样品）稀释液是60-80%的乙腈。

在样本稀释液中乙腈浓度较低的情况下，酪胺（碱性分析物）显示了ACE HILIC-B相和ACE HILIC-N相的分裂峰。
然而，这种效果对ACE HILIC-A并没有那么明显，峰形仍然很差。

对于60%以上的乙腈，所有ACE HILIC相的峰形都有改善。

扁桃酸的峰形通常不受ACE HILIC-B和ACE HILIC-N的样本（品）稀释液的影响。但是，对于ACE HILIC-A，有机浓度较低时峰形较差。
根据这个数据集，对于该HILIC应用，建议使用60-80%的乙腈样本（样品）稀释液。

对于各HILIC应用，建议进行此类系统研究。

如果可能的话，Z好采用较高浓度的分析物和较小的进样量。

这样可尽量减少（尽可能减少）对吸附水层的破坏。

样本（样品）溶解性与样本（样品）浓度之间的平衡（权衡）始终具有挑战，尤其是对于HILIC而言。

图8
（a）ACE HILIC-A相（b）ACE HILIC-B相和（c）ACE HILIC-N相中样本溶液对次黄嘌呤、酪胺和扁桃酸的色谱峰形的影响。
色谱柱：150 x 4.6 mm, 5μm

流动相：甲酸铵，pH4.7，（溶于MeCN/H2O中）（90:10 v/v）

流速：1.5mL/min

温度：25 °C

检测：UV, 254 nm

进样：5 μL

温度

温度是方法开发中一个很有用的参数。

温度对保留的影响程度取决于固定相和分析物二者。例如，分析物的pKa可能随着温度的变化而变化，从而影响电离和保留的程度。
据记载，对于HILIC，随着温度的升高，保留率有可能同时增加和减少，如图9中所示，分离出极性的酸性、碱性和中性分析物（极性的酸性、碱性和中性分析物的分离）。
在HILIC方法开发中，建议不要将温度作为优化选择性和分离的主要参数。

与色谱柱化学特性、有机物含量百分比或洗脱剂pH值等参数相比，在HILIC模式下它能改变保留率（保留的作用微弱）。

图9
下列相中温度对酸性、碱性和中性分析物混合物的分析物保
留率的影响:
(a) ACE 5 HILIC-A
(b) ACE 5 HILIC-N
(c) ACE 5 HILIC-B
色谱柱：150 x 4.6 mm
流动相：10 mM甲酸铵，pH4.7（溶于MeCN/H2O中）（90:10 v/v）
流速：1.5 mL/min
检测：UV, 230 nm
进样：5 μL
样本：
1) 4-羟基苯甲酸
2) 沙丁胺醇
3) 2’-脱氧鸟苷
4) 色氨酸