杂交瘤细胞的制作方法

杂交瘤技术又称细胞融合技术，是将两个或多个细胞融合成一个。 融合后形成的杂交瘤细胞承袭了两亲本细胞的特征。 自发的细胞融合很少发生，当加入一种融合剂，如：聚乙二醇（常用）、仙台病毒或溶血卵磷脂后，两种细胞就可发生融合。 首先是质膜互相融合，形成具有两个或多个核的异核体，细胞进一步分裂时，核互相融合，形成了杂交细胞。

杂交瘤技术优缺点：

优点：与传统的免疫动物方法制备抗体相比，利用杂交瘤技术可以制备出高纯度的单抗，并且可以进行单克隆抗体的大量生产。

缺点：a.操作步骤繁琐。b.利用杂交瘤技术生产出的单克隆抗体多为鼠源性，而鼠源性抗体在应用中有诸多问题，例如被人类免疫系统所识别，产生人抗鼠抗体( HAMA）反应、在人体循环系统中很快被清除等。

杂交瘤技术应用：

①诊断应用：单克隆抗体在疾病诊断中发挥了重要作用，其优点在于诊断准确且无交叉反应，例如在乙型肝炎及潜伏的乙型肝炎病毒的诊断中，单克隆抗体能显著减少假阴性的漏诊。

②治-疗载体：单克隆抗体也可作为治-疗疾病的载体。通过与抗肿瘤药物结合，单克隆抗体能在体内选择性集中攻击肿瘤细胞，具有靶向性，从而减少对正常组织的损伤并减轻抗-癌药物的副作用。因此，载药单克隆抗体被誉为“生物导-弹”。

③异种蛋白质问题：目前大多数单克隆抗体为鼠-鼠型，对于人体来说属于异种蛋白质，容易引起排异反应，限制了其在治-疗中的应用。

④人-人型单克隆抗体的研究：为了解决排异问题，研究者正在努力研发人-人型单克隆抗体，以利于其在治-疗中的广泛应用。

杂交瘤技术常见问题解析：

①电融合和PEG融合的区别？

PEG化学融合是利用聚乙二醇分子能够改变细胞膜结构的特性来实现细胞融合的过程。聚乙二醇可以使两个细胞接触点质膜的脂质分子发生疏散和重组，两个细胞接触部位的质膜由于相互亲和以及彼此的表面张力作用，从而发生细胞融合。电融合则是先通过高频交流电压，使细胞成串珠状排列，实现点接触；然后施加方波脉冲，击穿两个细胞接触部位的质膜，质膜脂质分子发生重组，同时由于细胞表面张力作用，完成细胞融合。电融合法比PEG融合法有明显的优点：细胞融合率高，有利于杂交瘤的筛选；电脉冲击穿对细胞的损伤小，有利于融合后细胞的生长增殖；可直接观察融合过程；便于有目的地控制选择融合条件。

②为什么要推荐进行2~3轮有限稀释获得稳定的杂交瘤细胞株？

阳性单克隆细胞的获得通常进行至少2轮有限稀释，原因主要考虑两点。第一，有限稀释过程中，大多数是通过实验者在显微镜下观察细胞团状态来判定是否是单克隆，存在一定的主观经验值，至少进行两轮有限稀释可以增加判断的准确性；第二，杂交瘤细胞由两个细胞融合而成，存在基因的不稳定性，连续2轮有限稀释，客观上增加了筛选中细胞培养时间，有利于淘汰不稳定的杂交瘤细胞株。

③为什么要使用核酸免疫？

重组蛋白由于免疫靶向明确、剂量可控等优势，通常作为动物免疫阶段的首-选免疫原。但有些重组蛋白因为表达纯化困难，很难大量获得并用于动物免疫；另外，重组蛋白与天然样本之间存在或多少的结构差异。而核酸免疫，跳过了蛋白表达纯化的过程，成功避开了蛋白生产的难题，通过核酸体内表达的蛋白结构也更加接近天然蛋白，故而可以作为重组蛋白免疫的有效补充手段。但核酸免疫的免疫剂量很难判断，整体免疫效价也会普遍低于蛋白和多肽免疫。

④除弗氏佐剂之外，免疫佐剂还有哪些？

免疫佐剂是指那些同抗原一起或预先注入机体内能增强机体对抗原的免疫应答能力或改变免疫应答类型的辅助物质。佐剂的免疫生物学作用是增强免疫原性、增强抗体的滴度、改变抗体产生的类型、引起或增强迟发超敏反应等。除经典的弗氏佐剂外，各类不同功能的佐剂也层出不穷，比较常见的有：1）无机佐剂，如磷酸铝佐剂、氢氧化铝佐剂；2）生物类佐剂，如以细菌胞壁或产物为主要组成的佐剂；3）具有佐剂活性的细胞因子类，如GSF、IL1、IL2、IFN -γ等；4）人工合成佐剂，如cpG等。

⑤杂交瘤融合后主克隆接种96孔细胞培养板数量通常是多少？

融合后的主克隆细胞接种96孔细胞培养板的数量与融合效率和脾细胞多少有密切关系。PEG化学融合后的主克隆，通常一只小鼠的脾细胞可以接种8-15块96孔细胞培养板；电融合因为融合效率大大提高，通常一只小鼠的脾细胞可以接种30~50块96孔细胞培养板。

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