人抗增殖细胞核抗原抗体(PCNA)检测试剂盒

本文由 上海信裕生物技术有限公司 整理汇编

2015-03-12 00:00 280阅读次数

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更多资料

• 人抗增殖细胞核抗原抗体(PCNA)检测试剂盒

  人抗增殖细胞核抗原抗体(PCNA)检测试剂盒[详细]

  2015-03-12 00:00

  安装说明

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• 大鼠抗增殖细胞核抗原抗体(PCNA)ELISA试剂盒

  大鼠抗增殖细胞核抗原抗体(PCNA)ELISA试剂盒[详细]

  2013-12-10 00:00

  应用文章

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• 小鼠抗增殖细胞核抗原抗体(PCNA)ELISA试剂盒

  小鼠抗增殖细胞核抗原抗体(PCNA)ELISA试剂盒[详细]

  2024-09-20 13:41

  实验操作

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• 小鼠抗增殖细胞核抗原（PCNA）说明书

  小鼠抗增殖细胞核抗原（PCNA）说明书实验原理：本试剂盒应用双抗原夹心法测定标本中小鼠抗增殖细胞核抗原（PCNA）水平。用纯化的抗原包被微孔板，制成固相抗原，往包被单抗的微孔中依次加入PCNA，再与HRP标记的抗原结合，形成抗原-抗体-酶标抗原复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成Z终的黄色。颜色的深浅和样品中的PCNA呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中小鼠PCNA浓度。小鼠抗增殖细胞核抗原（PCNA）说明书密封袋1个1个酶标包被板1×481×96标准品：270ng/L0.5ml×1瓶0.5ml×1瓶标准品稀释液1.5ml×1瓶1.5ml×1瓶酶标试剂3ml×1瓶6ml×1瓶样品稀释液3ml×1瓶6ml×1瓶显色剂A液3ml×1瓶6ml×1瓶目的：本试剂盒用于测定小鼠血清，血浆及相关液体样本中抗增殖细胞核抗原（PCNA）含量。小鼠抗增殖细胞核抗原（PCNA）说明书样本处理及要求：1.血清：室温血液自然凝固10-20分钟，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。2.血浆：应根据标本的要求选择EDTA或柠檬酸钠作为抗凝剂，混合10-20分钟后，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应该再次离心。3.尿液：用无菌管收集，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。胸腹水、脑脊液参照实行。4.细胞培养上清：检测分泌性的成份时，用无菌管收集。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。检测细胞内的成份时，用PBS（PH7.2-7.4）稀释细胞悬液，细胞浓度达到100万/ml左右。通过反复冻融，以使细胞破坏并放出细胞内成份。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。5.组织标本：切割标本后，称取重量。加入一定量的PBS，PH7.4。用液氮迅速冷冻保存备用。标本融化后仍然保持2-8℃的温度。加入一定量的PBS（PH7.4），用手工或匀浆器将标本匀浆充分。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。分装后一份待检测，其余冷冻备用。6.标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。若不能马上进行试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融.7.不能检测含NaN3的样品，因NaN3YZ辣根过氧化物酶的（HRP）活性。操作步骤标准品的稀释与加样：在酶标包被板上设标准品孔10孔，在**、第二孔中分别加标准品100μl，然后在**、第二孔中加标准品稀释液50μl，混匀；然后从**孔、第二孔中各取100μl分别加到第三孔和第四孔，再在第三、第四孔分别加标准品稀释液50μl，混匀；然后在第三孔和第四孔中先各取50μl弃掉，再各取50μl分别加到第五、第六孔中，再在第五、第六孔中分别加标准品稀释液50ul，混匀；混匀后从第五、第六孔中各取50μl分别加到第七、第八孔中，再在第七、第八孔中分别加标准品稀释液50μl，混匀后从第七、第八孔中分别取50μl加到第九、第十孔中，再在第九第十孔分别加标准品稀释液50μl，混匀后从第九第十孔中各取50μl弃掉。（稀释后各孔加样量都为50μl，浓度分别为180ng/L，120ng/L，60ng/L，30ng/L，15ng/L）。加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、待测样品孔。在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl（样品Z终稀释度为5倍）。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟。配液：将30（48T的20倍）倍浓缩洗涤液用蒸馏水30（48T的20倍）倍稀释后备用。洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。加酶：每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外。温育：操作同3。洗涤：操作同5。显色：每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15分钟.终止：每孔加终止液50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。测定：以空白空调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度（OD值）。测定应在加终止液后15分钟以内进行。小鼠抗增殖细胞核抗原（PCNA）说明书[详细]

  2018-10-23 10:30

  产品样册

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• 鱼增殖细胞核抗原抗体（PCNA）ELISA试剂盒说明书

  鱼增殖细胞核抗原抗体（PCNA）ELISA试剂盒说明书[详细]

  2015-05-13 00:00

  专利

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• 人增殖细胞核抗原（PCNA）ELISA试剂盒说明书

  电话：021-6533363955229872网址：http://www.westang.com人增殖细胞核抗原（PCNA）ELISA试剂盒（用于血清、血浆、细胞培养上清液和其它生物体液内）原理本实验采用双抗体夹心ABC-ELISA法。用抗人PCNA单抗包被于酶标板上，标准品和样品中的PCNA与单抗结合，加入生物素化的抗人PCNA，形成免疫复合物连接在板上，辣根过氧化物酶标记的Streptavidin与生物素结合，加入底物工作液显蓝色，Z后加终止液硫酸，在450nm处测OD值，PCNA浓度与OD值成正比，可通过绘制标准曲线求出标本中PCNA浓度。试剂盒组成（2-8℃保存）酶标板（CoatedWells）96孔酶标抗体工作液（EnzymeConjugate）12ml10×标本稀释液（SampleBuffer）12ml20×浓缩洗涤液（WashBuffer）50ml标准品（Standards）：20U/瓶2瓶底物工作液（TMBSolution）12ml**抗体工作液（BiotinylatedAntibody）12ml终止液（StopSolution）12ml准备试剂与收集血样1.收集标本：血清、血浆（EDTA、柠檬酸盐、肝素抗凝）、细胞培养上清液、组织匀浆等尽早检测，2-8℃保存48小时；更长时间须冷冻（-20℃或-70℃）保存，避免反复冻融。2.标准品液配制：使用前加入1ml蒸馏水混匀，配成20000mU/ml的溶液。设标准管8管，**管加标本稀释液900ul，第二至第八管加入标本稀释液500ul。在**管中加入20000mU/ml的标准品溶液100ul混匀后用加样器吸出500ul，移至第二管。如此反复作对倍稀释，从第七管中吸出500ul弃去。第八管为空白对照。3.10×标本稀释液用蒸馏水作1:10倍稀释（示例：1ml浓稀释液+9ml蒸馏水）。4.洗涤液：用重蒸水1:20稀释（示例：1ml浓缩洗涤液加入19ml的重蒸水）检测程序1.加样：每孔各加入标准品或待测样品100ul，将反应板充分混匀后置37℃120分钟。2.洗板：用洗涤液将反应板充分洗涤4-6次，向滤纸上印干。3.每孔中加入**抗体工作液100ul。将反应板充分混匀后置37℃60分钟。4.洗板：同前。5.每孔加酶标抗体工作液100ul。将反应板置37℃30分钟。6.洗板：同前。7.每孔加入底物工作液100ul，置37℃暗处反应15分钟。8.每孔加入100ul终止液混匀。9.30分钟内用酶标仪在450nm处测吸光值。结果计算与判断1.所有OD值都应减除空白值后再行计算。2.以标准品2000、1000、500、250、125、62.5、31.2、0mU/ml为横坐标，OD值为纵坐标，在坐标纸上作图，画出标准曲线。3.根据样品OD值在该曲线图上查出相应PCNA含量即可。试剂盒性能1.灵敏度：Z小的PCNA检测浓度小于15mU/ml。2.特异性：可同时检测重组或天然的人PCNA。不与人其它细胞因子有交叉反应。3.重复性：板内、板见变异系数均小于10％。注意事项1.以上标准孔及待测样品均建议做复孔，每次测定应同时做标准曲线。2.洗涤过程很关键。洗涤不充分将导致极ng确度误差及OD值错误地升高。3.板条开封后剩余板条要再封好，保持板条干燥。4.本试剂盒宜置4oC冰箱保存。5.本试剂盒仅用于科研，不能用于临床诊断！[详细]

  2018-09-13 10:01

  产品样册

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• 大鼠增殖细胞核抗原（PCNA）ELISA试剂盒

  大鼠增殖细胞核抗原（PCNA）ELISA试剂盒（用于血清、血浆、细胞培养上清液和其它生物体液内）原理本实验采用双抗体夹心ABC-ELISA法。用抗大鼠PCNA单抗包被于酶标板上，标准品和样品中的PCNA与单抗结合，加入生物素化的抗大鼠PCNA，形成免疫复合物连接在板上，辣根过氧化物酶标记的Streptavidin与生物素结合，加入底物工作液显蓝色，Z后加终止液硫酸，在450nm处测OD值，PCNA浓度与OD值成正比，可通过绘制标准曲线求出标本中PCNA浓度。试剂盒组成（2-8℃保存）酶标板（CoatedWells）96孔酶标抗体工作液（EnzymeConjugate）12ml10×标本稀释液（SampleBuffer）12ml20×浓缩洗涤液（WashBuffer）50ml标准品（Standards）：20U/瓶2瓶底物工作液（TMBSolution）12ml**抗体工作液（BiotinylatedAntibody）12ml终止液（StopSolution）12ml准备试剂与收集血样1.收集标本：血清、血浆（EDTA、柠檬酸盐、肝素抗凝）、细胞培养上清液、组织匀浆等尽早检测，2-8℃保存48小时；更长时间须冷冻（-20℃或-70℃）保存，避免反复冻融。2.标准品液配制：使用前加入1ml蒸馏水混匀，配成20000mU/ml的溶液。设标准管8管，**管加标本稀释液900ul，第二至第八管加入标本稀释液500ul。在**管中加入20000mU/ml的标准品溶液100ul混匀后用加样器吸出500ul，移至第二管。如此反复作对倍稀释，从第七管中吸出500ul弃去。第八管为空白对照。3.10×标本稀释液用蒸馏水作1:10倍稀释（示例：1ml浓稀释液+9ml蒸馏水）。4.洗涤液：用重蒸水1:20稀释（示例：1ml浓缩洗涤液加入19ml的重蒸水）检测程序1.加样：每孔各加入标准品或待测样品100ul，将反应板充分混匀后置37℃120分钟。2.洗板：用洗涤液将反应板充分洗涤4-6次，向滤纸上印干。3.每孔中加入**抗体工作液100ul。将反应板充分混匀后置37℃60分钟。4.洗板：同前。5.每孔加酶标抗体工作液100ul。将反应板置37℃30分钟。6.洗板：同前。7.每孔加入底物工作液100ul，置37℃暗处反应15分钟。8.每孔加入100ul终止液混匀。9.30分钟内用酶标仪在450nm处测吸光值。结果计算与判断1.所有OD值都应减除空白值后再行计算。2.以标准品2000、1000、500、250、125、62.5、31.2、0mU/ml为横坐标，OD值为纵坐标，在坐标纸上作图，画出标准曲线。3.根据样品OD值在该曲线图上查出相应PCNA含量即可。试剂盒性能1.灵敏度：Z小的PCNA检测浓度小于15mU/ml。2.特异性：可同时检测重组或天然的大鼠PCNA。不与大鼠其它细胞因子有交叉反应。3.重复性：板内、板见变异系数均小于10％。注意事项1.以上标准孔及待测样品均建议做复孔，每次测定应同时做标准曲线。2.洗涤过程很关键。洗涤不充分将导致极ng确度误差及OD值错误地升高。3.板条开封后剩余板条要再封好，保持板条干燥。4.本试剂盒宜置4oC冰箱保存。5.本试剂盒仅用于科研，不能用于临床诊断！[详细]

  2018-09-13 10:00

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• 人抗肝可溶性抗原抗体(SLA)检测试剂盒

  人抗肝可溶性抗原抗体(SLA)检测试剂盒[详细]

  2015-03-12 00:00

  实验操作

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• 人抗可提取核抗原抗体(ENA-Ab)检测试剂盒

  人抗可提取核抗原抗体(ENA-Ab)检测试剂盒[详细]

  2015-03-12 00:00

  其它

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• 人抗中性粒细胞核周抗体(pANCA)检测试剂盒

  人抗中性粒细胞核周抗体(pANCA)检测试剂盒[详细]

  2015-03-12 00:00

  期刊论文

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• 人抗肝可溶性抗原抗体(SLA)ELISA试剂盒

  人抗肝可溶性抗原抗体(SLA)ELISA试剂盒[详细]

  2013-12-17 00:00

  其它

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• 人抗可提取核抗原抗体(ENA-Ab)ELISA试剂盒

  人抗可提取核抗原抗体(ENA-Ab)ELISA试剂盒[详细]

  2013-12-17 00:00

  课件

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• ELISA试剂盒抗原抗体包被的方式

  ELISA试剂盒抗原抗体包被的方式上海恒远生物科技有限公司专业Elisa生产商，dai理商，欢迎广大客户前来咨询订购。　　将抗原或抗体固定在固相载体上的过程称为包被(coating)。换言之，包被即是抗原或抗体结合到固相载体表面的过程。蛋白质与聚苯乙烯固相载体是通过物理吸附结合的，靠的是蛋白质分子结构上的疏水基团与固相载体表面的疏水基团间的作用力。这种物理吸附是非特异性的，受蛋白质的分子量、等电点、浓度等的影响。载体对不同蛋白质的吸附能力是不相同的，大分子蛋白质较小分子蛋白质通常含有更多的疏水基团，故更易吸附到固相载体表面。IgG对聚苯乙烯等固相具有较强的吸附力，其联结多发生在Fc段上，抗体结合点暴露于外，因此抗体的包被一般均采用直接吸附法。蛋白质抗原大多也可采用与抗体相似的方法包被。当抗原决定簇存在于或邻近于疏水区域时，抗原与固相载体的直接吸附可使抗原决定簇不能充分暴露，在这种情况下，直接包被效果不佳，可以采用间接的捕获包被法，即先将针对该抗原的特异抗体作预包被，其后通过抗原抗体反应使抗原固相化。此间接结合在固相上的抗原远离载体表面，其抗原决定簇也得以充分暴露。间接包被的抗原经固相抗体的亲和层析作用，包被在固相上的抗原纯度大大提高，因此含杂质较多的抗原也可采用捕获包被法，试验的特异性、敏感性均由此得以改善，重复性亦佳。间接包被的另一优点是抗原用量少，仅为直接包被的1/10乃至于/100。不易吸附在聚苯乙烯载体上的非蛋白质抗原可采用特殊的包被方式。例如，在检测抗DNA抗体时，需用DNA作为包被抗原，而普遍的固相载体一般不能直接与核酸结合。可将聚苯乙烯板先经紫外线照射（例如30W紫外灯，75cm照射12小时），以增加其吸附性能。固相载体先用碱性蛋白质，如聚赖氨酸、鱼精蛋白等作预包被，也可提高核酸的结合力。也可用亲和素生物素系统作间接包被，即用亲和素先包被载体，然后加入生物素化的DNA，这种包被方法均匀、牢固，已扩大应用于各种抗原物质的定量测定。　　脂类物质无法与固相载体结合，可将其在有机溶剂（例如乙醇）中溶解后加入ELISA板孔中，开盖置冰箱隔夜或冷风吹干，待酒精挥发后，让脂质自然干固在固相表面。抗心磷脂抗体的ELISA试剂一般采用这种包被方式。[详细]

  2018-11-16 10:02

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• 蓝色荧光细胞核染色分析试剂盒产品说明书

  主要用途蓝色荧光细胞核染色分析试剂是一种旨在通过使用荧光染料DAPI与细胞核DNA特异性结合，并发出荧光检测信号，用于分析和观察细胞核形态或DNA含量以及双重染色或重叠染色定位的权威而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。其适用于各种细胞核（动物、人体、植物、昆虫等）的观察。产品即到即用，性能稳定，荧光清晰。技术背景作为细胞DNA染色剂之一的4,6-二咪基－4-联苯基吲哚（4,6-diamidino-2-phenylindole；DAPI）特异性地与DNA双螺旋的凹槽部分发生相互作用，从而与DNA的双链紧密结合。结合后产生的荧光基团的吸收峰是358nm而散射峰是461nm，正好是UV（紫外光）的激发波长356nm，使得DAPI成为一种常用的荧光检测信号，并作为双重染色或重叠染色的主要染色剂之一。产品内容清理液（ReagentA）毫升固定液（ReagentB）毫升扩张液（ReagentC）毫升染色液（ReagentD）毫升抗淬灭剂（ReagentE）毫升产品说明书1份保存方式保存固定液（ReagentB）、染色液（ReagentD）和抗淬灭剂（ReagentE）在－20℃冰箱里；其余的保存在4℃冰箱里；染色液（ReagentD）和抗淬灭剂（ReagentE）避免光照；有效保证6月用户自备微型台式离心机：用于悬浮细胞的操作盖玻片：用于染色后封片荧光显微镜：用于观察细胞核DNA染色[详细]

  2018-11-19 10:00

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• 细胞核基质的基本特征

  细胞核基质的基本特征1．核基质的一般形态结构要在电镜下观察到核基质，一般的方法为生化抽提技术加上整装样品电镜技术，方可清晰地显示核骨架一核纤层一中间纤维网架结构体系。由蛋白纤维构成的网架结构充满核内的整个空间．残存的核仁被包围在该网架中。核纤层由中间纤维蛋白构成，位于内层核膜下方，核基质的纤维网架与核纤层有着广泛的结构联系。核基质纤维粗细不均，直径可为3～30nm，推测其纤维单体的直径是3～4nm，较粗的纤维直径呈3nm的倍数，提示为单纤维的聚合体。2．核基质的化学成分由于提取方法和所用盐溶液的不同，在电泳上显示的核基质蛋白成分有相当的差异。核基质成分较为复杂，不像细胞质骨架和核纤层那样简单，不同类型细胞，其细胞周期不同阶段以及正常与癌变细胞的核基质成分都可能有所差别。已检测出的核基质成分有10多种．相对分子质量为40～60kD，多数是非组蛋白成分，其中相当一部分为含硫蛋白质。二琉键对核基质完整性起极为重要的作用，破坏二硫键可引起核基质的瓦解。由于核基质蛋白成分常与一部分DNA和RNA有紧密的结合，与RNA的结合对于维持核骨架三维网络结构的完整性是必要的，与少量DNA的结合是一种功能性结合，所以有人认为核基质成分应该说是一类核蛋白。常见的核基质蛋白有下列几种：(1)核基质蛋白，相对分子质量大于50k1)，主要定位于核基质，且呈现纤维颗粒样分布。很可能是核基质上DNA襻环的结合蛋白。(2)Nuc2+蛋白，Nuc2+蛋白存在于核基质以及染色体支架中。相对分子质量为76kD，有一个结构域与富含AT的DNA序列有特异的亲和性。Nuc2+蛋白能在体外自我组装，是一种具有聚合能力的酸性结合蛋白质。Nuc2+蛋白可能在有丝分裂期染色体分离过程中起重要作用。(3)核内肌动蛋白，有报道在间期细胞核内发现肌动蛋白，这些核基质中的肌动蛋白可能与mRNA前体的加工过程有关，如果向细胞核内注射抗肌动蛋白抗体及肌动蛋白结合蛋白，能YZ细胞核内的mRNA的转录。(4)附着区结合蛋白，与骨架结合的DNA序列(简称MAR)往往是富含AT的DNA序列．长度：300～1000bp。是一种MAR结合蛋白，相对分子质量为95kD，广泛存在于各种组织中，不具有组织特异性。通常特异性地与DNA襻环两端的序列结合，将其锚定在核基质上，以形成DNA襻环。(5)DNA拓扑异构酶Ⅱ，是间期的核基质和分裂期染色体骨架的重要成分之一。3．核基质结合蛋白近年陆续发现了一些核骨架结合蛋白，又称核基质结合蛋白，是一些与DNA和RNA代谢密切相关的酶类、细胞信号识别和细胞周期的调控因子以及病毒特异性的调控蛋白，紧密地结合在核基质结构上，协助核基质蛋白共同完成核基质网架的构建和生物学功能。4．核基质的功能一般认为，核基质为细胞核内组分布局提供了一个结构支架，细胞核内许多重要的生命活动与核基质有关。(1)核基质与DNA复制原核细胞的DNA复制是结合在细胞膜上进行的。近年来研究表明真核细胞中DNA复制与核膜没有直接的关系，更无专一的结合位点，复制中的DNA均结合在核基质上，并且DNA复制所必需的DNA聚合酶和DNA拓扑异构酶Ⅱ都可能在核基质上有特定的结合位点。DNA襻环的根部结合在基质纤维上，DNA以襻环的形式通过核基质结合序列与DNA拓扑异构酶Ⅱ的结合锚定到核基质上，调控DNA的复制。与DNA复制有关的酶及调控因子与DNA襻环共同锚定于核基质上形成DNA复制复合体，进行DNA复制合成。近年来证实，真核细胞中的DNA聚合酶结合于核基质上，通过结合于核基质上而被激活。所以可以认为，在真核细胞中核基质是DNA复制的空间支架。(2)核基质与基因表达在细胞核这样的小小的空间内容纳基因要有序表达，必须在时空上进行有序的调节，在一定时间内只有极少数基因活跃表达，其他基因暂时处于关闭状态。在鸟类和哺乳动物细胞中，具有转录活性的基因是结合在核基质上的，基因只有结合在核基质上才能进行转录。具有转录活性的基因两端存在MAR序列，可以经DNA拓扑异-构酶Ⅱ结合到核基质上，并且MAR序列的存在可增加基因的转录活性。核基质是DNA-的转录位点,RNA的合成是在核基质上进行，RNA聚合酶在核基质上具有结合位点。另外,RNA的剪切加工与运输也是在核基质上进行，mRNA前体(hnRNA)与核基质的相结合，hnRNA上的特异性片段polyA可能是hnRNA在核基质上的附着点。(3)核基质和细胞癌变有些癌细胞如肝细胞的核基质结构很不规则，而且其蛋白组成l与正常细胞核基质有显著不同。肿瘤细胞核常呈异常的形态结构，与核基质结构及其蛋白组成的异常密切相关。有实验证明，癌基因是结合在核基质上才能转录。一些致癌物、促癌剂能紧密与核基质结合，并通过核基质发挥其致癌、促癌作用。某些YZ癌细胞增殖的药物可能通过干扰基质的DNA拓扑异构酶II起作用的。[详细]

  2024-10-03 18:27

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• 人骨粘连蛋白(ON)检测试剂盒

  人骨粘连蛋白(ON)检测试剂盒[详细]

  2015-03-17 00:00

  其它

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• 人血吸虫检测试剂盒

  人血吸虫检测试剂盒[详细]

  2015-03-06 00:00

  标准

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• 人preptin 检测试剂盒

  人preptin 检测试剂盒[详细]

  2024-10-04 05:44

  其它

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• 蓝色荧光细胞核染色分析试剂盒产品说明书（中文版）

  蓝色荧光细胞核染色分析试剂盒产品说明书（中文版）[详细]

  2014-12-17 00:00

  期刊论文

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• 磷酸化细胞核因子 p-p65NFKB多抗

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  2018-11-05 10:00

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