环形细胞侵袭实验--使细胞侵袭的过程可视化

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• 环形细胞侵袭实验--使细胞侵袭的过程可视化

  环形细胞侵袭实验--使细胞侵袭的过程可视化[详细]

  2016-06-03 00:00

  课件

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• 肿瘤细胞侵袭实验原理 材料 步骤

  一原理Matrigel是从小鼠EHS肉瘤中提取的基质成分，含有LN、IV型胶原、接触蛋白和肝素硫酸多糖，铺在无聚乙烯吡硌烷酮的聚碳酸酯滤膜上，能在DMEM培养基中重建形成膜结构，这种膜结构与天然基质膜结构极为相似。滤膜孔径一般为8um，而且膜孔都被Matrigel覆盖，细胞不能自由穿过，必须分泌水解酶，并通过变形运动才能穿过这种铺有Martrigel的滤膜，这与体内情况较为相似。铺有Martrigel的滤膜放在以BDFalcon细胞小室上下室之间，铺有Martrigel面朝向上室，在下室中加有趋化剂，如一定浓度的LN、FN或小鼠3T3条件培养液或人睾丸上皮成纤维细胞培养液，上室加入重悬的瘤细胞，具有侵袭能力的细胞在趋化剂诱导下开始穿膜运动。细胞穿膜所用的时间与Martrigel的用量有关，选择25ugMartrigell铺膜，16小时后观察结果较为合适。穿过滤膜的细胞多数粘附在滤膜下表面，可用棉签将上表面的细胞拭去，然后用乙醇固定滤膜，PE染色，在光镜下观察统计穿过Martrigel的细胞数。另外用BDFalcon细胞小室也可进行重建基质膜侵袭分析，这一方法是在BDFalcon细胞小室吊篮式上腔的滤膜上铺上30ugMartrigel，加入细胞72h后观察结果。值得注意的是，细胞在BDFalcon细胞小室中培养72小时后，有相当数量穿过滤膜的细胞不再粘附在滤膜下表面，而是脱落进人下腔溶液中．因此统计穿过基质膜的细胞数目时应把这部分细胞考虑在内。肿瘤细胞穿过重建基质膜的能力与它的体内侵袭转移能力表现出较好的相关性，可以用重建基质膜模型初筛抗侵袭药物。在上述分析中，如果不在膜上铺Martrigel而直接将8um孔径滤膜安放在侵袭腔室上下腔室之间，细胞通过变形运动穿过滤膜，用这种模型对分析细胞运动能力和药物对细胞运动能力的影响。另外，在下室中加有LN或FN或在滤膜下表面铺上LN或FN，可分析药物对肿瘤细胞的趋化性或趋固性的影响。二材料1.Matrigel基质胶（BDBIOCOAT#356234），5ml，分装成0.5ml/只10个EP管中；用时加入0.5ml的DMEM；Matrivgel在冰上维持液态，室温时可迅速凝结成胶。使用前应从-20℃转移至4℃待其自然溶化（如过夜放置），避免反复冻融。使用时需接触Matrivgel的试管、移液吸头等均应预冷于4℃；注意无菌操作；2.8ul，24孔配套细胞小室（BDFaclon#353097）；3.结晶紫染料溶液：结晶紫用甲醇配成0.5%的母液，使用浓度为0.1％，用PBS按1：4稀释后即为染色液；4.33%醋酸；1.溶液配制：（1）.溶DMEM500ml；NE---A液（1μg/μl，1mg/ml）母液0.1ml（5mg）+ddH2Oupto5ml；过滤消毒，-20℃保存。NE-DMEM（-6M）NE---A液（1μg/μl，1mg/ml）20.5μlDMEMUPTO100ml过滤消毒，4℃保存（2）.NE+CGRP-DMEM（-6M，100ng）NE---A液（1μg/μl，1mg/ml）20.5μlCGRP-储存液50μlDMEMUPTO100ml过滤消毒，4℃保存（3）.NE+IFN-DMEM（-6M，50ng）NE---A液（1μg/μl，1mg/ml）20.5μlIFN-γ（25ng/μl）25μlDMEMUPTO100ml过滤消毒，4℃保存（4）.低血清DMEM培养基（上室）（5）.20%FBS-DMEM培养基（下室）2.准备（1）.溶胶，4℃过夜（ThawMatrigelat4℃overnight.）（2）.室温下基质胶易成凝胶，所以，步骤2和3种使用试管和枪头要在试验前-20C预冷。（Matrigeltendstoformgelveryquicklyatroomtemerature,therefore,pipetsandtipsusinginsteps2and3havetobechilledatpriortoexperiements.）3.包被基底膜（冰上操作）（1）.用无血清的冷细胞培养基DMEM稀释Matrigel胶（10mg/mlto5mg/ml））（DiluteMatrigel（10mg/mlto5mg/ml）inserumfree-coldcellculturemedia（RPMI1640,EMEM,DMEM,etc）.）（2）.取100ul稀释胶加到24-well细胞小室的上室中（Put100ulofthedilutedmatrigelintoupperchamberof24-welltranswell）（3）.37℃孵育transwell至少4-5h（Incubatethetranswellat37Catleast4to5hforgel领.）4.水化基底膜用无血清培养基轻洗凝胶（Gentlywashgelledmatrigelwithwarmedserumfree-culturemedia.）5.准备细胞悬液和小室（1）.消化法从细胞培养瓶中获取细胞；（HarvestcellsfromtissuecultureflasksbyTrypsin/EDTA；）（2）.用培养基洗3遍（Washthecells3timeswithculturemedia（RPMI1640,EMEM,DMEMetc）containing1%FBS.）（3）.重选细胞，5×105cells/ml，1%FBS（Resuspendthecellsinmediacontaining1%FBSatadensityof5×105cells/ml.）（4）.上室加200ul细胞悬液（Put200ulofthecellsuspensionontothematrigel.）（5）.下室中加入600ul细胞培养基，含有5ug/mlfibronectin作为黏连亚族（lowerchamberofthetranswellisfilledwith600ulofculturemediacontaining,asanadhesivesubtrate.）6.孵育，37℃，20to24h（Incubateat37Cfor20to24h.7.染色和计数（1）.棉签擦去上室上面的非侵袭细胞（Scrapeoffnoninvadedcellsonthetopofthetranswellwithacottonswab）（2）.移去transwells，倒置，风干（Removetranswellsfrom24-wellplatesandstainedwithDiff-Quicksolution.）（3）.24孔板中加入500l含0.1%结晶紫，将小室置于其中，使膜浸没在培养基中，37℃30min后取出，PBS清洗。（4）.直径上取4个视野，照相，计数。（5）.24孔板中加入500l33%醋酸，将小室置于其中，浸膜，振荡10min，充分溶解。取出小室，24孔板于酶标仪上570nm测OD值，间接反应细胞数。小技巧：照相前一定要晾干，照相时将小室正置于载玻片上，在倒置显微镜下观察、照相。经济、实用、方便。[详细]

  2018-09-02 10:00

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• FH1158-人侵袭性脉络膜黑色素瘤细胞；MUM2B

  FH1158-人侵袭性脉络膜黑色素瘤细胞；MUM2B[详细]

  2024-05-30 09:33

  应用文章

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• 基质金属蛋白酶-2与胃癌的侵袭转移

  基质金属蛋白酶-2与胃癌的侵袭转移[详细]

  2012-12-25 00:00

  安装说明

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• 基质金属蛋白酶-2与胃癌的侵袭转移

  基质金属蛋白酶-2与胃癌的侵袭转移[详细]

  2024-09-17 01:52

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• 细胞成团和细胞出芽实验

  细胞成团和细胞出芽实验[详细]

  2016-05-12 00:00

  期刊论文

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• 猪侵袭性大肠杆菌（EIEC）酶联免疫分析试剂盒使用说明书

  猪侵袭性大肠杆菌(EIEC)酶联免疫分析试剂盒使用说明书本试剂盒仅供研究使用。96T使用目的：本试剂盒用于测定猪血清、血浆及相关液体样本中侵袭性大肠杆菌(EIEC)表达。实验原理本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中猪侵袭性大肠杆菌(EIEC)表达。用纯化的猪侵袭性大肠杆菌(EIEC)抗体包被微孔板，制成固相抗体，可与样品中侵袭性大肠杆菌(EIEC)相结合，经洗涤除去未结合的抗原和其他成分后再与HRP标记的侵袭性大肠杆菌(EIEC)抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成Z终的黄色。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），与CUTOFF值相比较，从而判定标本中猪侵袭性大肠杆菌(EIEC)的存在与否。猪侵袭性大肠杆菌(EIEC)酶联免疫分析试剂盒标本要求1．标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。若不能马上进行试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融2．不能检测含NaN3的样品，因NaN3YZ辣根过氧化物酶的（HRP）活性。操作步骤1.编号：将样品对应微孔按序编号，每板应设阴性对照2孔、阳性对照2孔、空白对照1孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）2.加样：分别在阴、阳性对照孔中加入阴性对照、阳性对照50μl。然后在待测样品孔先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀，3.温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟。4.配液：将30倍浓缩洗涤液用蒸馏水30倍稀释后备用5.洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。6.加酶：每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外。7.温育：操作同3。8.洗涤：操作同5。9.显色：每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15分钟.10.终止：每孔加终止液50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。11.测定：以空白空调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度（OD值）。测定应在加终止液后15分钟以内进行。猪侵袭性大肠杆菌(EIEC)酶联免疫分析试剂盒计算和结果判定：试验有效性：阳性对照孔平均值≥1.00;阴性对照平均值≤0.10临界值（CUTOFF）计算：临界值=阴性对照孔平均值+0.15阴性判定：样品OD值<临界值（CUTOFF）者为侵袭性大肠杆菌(EIEC)阴性阳性判定：样品OD值≥临界值（CUTOFF）者为侵袭性大肠杆菌(EIEC)阳性。注意事项1．操作严格按照说明书进行，本试剂不同批号组分不得混用。2．试剂盒从冷藏环境中取出应在室温平衡15-30分钟后方可使用，酶标包被板开封后如未用完，板条应装入密封袋中保存。3．浓洗涤液可能会有结晶析出，稀释时可在水浴中加温助溶，洗涤时不影响结果。4．封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。5．底物请避光保存。6．试验结果判定必须以酶标仪读数为准，使用双波长检测时，参考波长为630nm7．所有样品，洗涤液和各种废弃物都应按传染物处理。终止液为2M的硫酸，使用时必须注意安全。猪侵袭性大肠杆菌(EIEC)酶联免疫分析试剂盒保存条件及有效期1．试剂盒保存：；2-8℃。2．有效期：6个月[详细]

  2018-09-14 10:00

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• 细胞趋化实验新方法（二）--实时观察细胞动态

  细胞趋化实验新方法（二）--实时观察细胞动态[详细]

  2016-04-26 00:00

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• 细胞趋化实验新方法：可实时观察细胞动态

  细胞趋化实验新方法：可实时观察细胞动态[详细]

  2016-04-26 00:00

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• 免疫沉淀的实验过程

  上海金穗生物公司是一家专业经营生物试剂、标准品、试剂耗材的公司，生物引擎在广大用户的帮助和支持下，经过不懈的努力，已成为国内生命科学领域产品的主要供应商之一，主要经营ELISA试剂盒、细胞、血清、抗体、金标试剂盒、生物试剂、耗材、培养基、一抗、二抗等产品，产品畅销国内大部分地区，销售额逐年稳步提高。上海金穗生物公司拥有雄厚的实力、合理的价格和优良的服务，能够及时解决和满足客户的各方面的需求，公司的服务和业务网络遍及全国，在同行获得一致好评。www.shjsbio.com[详细]

  2018-10-08 10:00

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• 细胞如何做好转染实验及提高实验效率

  细胞如何做好转染实验及提高实验效率①从健康细胞开始Ⅰ转染实验前，细胞解冻后传代34次。这使得细胞从解冻过程中恢复过来，并恢复正常的生长速度。Ⅱ仅使用活性>90%的细胞使用台盼蓝染色可轻松测定细胞活性。Ⅲ定期传代细胞，切勿让细胞长到汇合状态或过度生长。如果让细胞长到汇合状态，可能会改变细胞的生长速度以及形态。a.请在汇合率达到90%之前对细胞进行传代。我们建议您使用胰酶替代物Cellstripper试剂(Corning25-056-CI)使细胞脱壁。Cellstripper试剂可于室温下存储在通风橱中。可通过添加过量的Cellstripper来跳过PBS洗涤的步骤，然后吸弃全部液体，仅留可覆盖瓶子表面的液体。b.传代条件取决于所用的细胞系。部分经验法则：对于快速生长的细胞，倍增时间为16小时(如HEK-293)，按1：10的比例分瓶。对于生长缓慢的细胞，倍增时间为36小时(如原代细胞)，按1：5的比例分瓶。Ⅳ保留冻存的细胞系，并定期解冻新细胞。传代次数高(>3040)时，细胞的生长速度和形态会改变。②进行实验之前，请先规划您的实验。务必要熟悉实验方案、确定所需的材料量，并在开始实验前确认所需的一切物品条件均已齐备。Ⅰ开始前，设计好铺板路线图，标注好每次处理或实验条件。Ⅱ计算所需脂质体和DNA的储备量，并确认有足够的下列材料：TransfectGRO减血清培养基(Corning40-300-CVR)，Lipofectamine2000或LipofectamineLTX试剂，以及DNA(0.51g/L)。③转染时，请使用优质DNA。Ⅰ使用无内毒素的试剂盒和实验方案制备DNA。Ⅱ通过测量OD260/280值来确定DNA纯度，测得的OD值应介于1.71.9]之间。数值过高或过低均说明有杂质，不宜用于转染实验。Ⅲ在无DNA/RNA酶的水或TE中稀释DNA。Ⅳ制备的工作浓度为0.51g/L。可用SpeedVac浓缩仪或透析过滤装置(例如，MilliporeAmicon超滤管)来浓缩DNA。④转染当天，将细胞铺板。Ⅰ如果在转染前一天或更早时间铺板，转染效率可能下降。Ⅱ转染时，细胞密度保持在汇合率为7090%。Ⅲ转染时，细胞密度影响转染效率。为了简化转染优化过程或节省时间，我们建议细胞铺成2种不同的密度，以确保较高的转染效率。Ⅳ细胞的铺板和转染可同时进行，或者通过反向转染操作进行。反向转染操作中，使用的细胞是正常/正向转染的2.5倍以上。Ⅴ转染复合物可以加到含抗生素和血清的培养基中，且不会影响转染效率。[详细]

  2024-10-03 20:15

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• 细胞趋化实验--EphA3+ MSCs细胞 对高浓度的IIIA4有负趋

  细胞趋化实验--EphA3+ MSCs细胞 对高浓度的IIIA4有负趋[详细]

  2016-05-24 00:00

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• 细胞琼脂克隆斑形成实验方法

  细胞琼脂克隆斑形成实验方法1.取MDA-435-OL-Sec23a-GFP和MDA-435-OLLV3NC-GFP对数生长期的细胞制成单细胞悬液,使用血细胞计数板计数后备用。2.使用梯度稀释法适当稀释细胞悬液后,向6孔板的每个孔内分别加入含50个细胞的2mL细胞悬液,细胞悬液使用含10%FBS的DMEM培养液配制。每种细胞均设置3个6孔板复孔。3.12h后镜下可观察到6孔板内细胞已经全部贴壁,此时将皿中培养液换成琼脂浓度为0.2%的含10%FBS的DMEM培养液,置于37°C培养箱内培养。4.10d后镜下可观察到6孔板内出现集落生长的细胞克隆斑。此时弃去含琼脂的培养液,用PBS轻轻润洗2次,然后6孔板内每孔加入2mL冰甲醇固定30min,固定结束后使用PBS轻轻润洗2次,然后使用结晶紫染色5min,再用PBS轻轻润洗后室温干燥。5.干燥完成后将6孔板移至显微镜下观察计数每个孔内细胞克隆斑数量,超过50个细胞的克隆斑即可计数。根据细胞克隆斑形成率=(克隆数/接种细胞数)×1**%来计算细胞体外克隆率。[详细]

  2024-10-03 20:15

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• 基因芯片实验中的细胞和组织制备规程

  基因芯片实验中的细胞和组织制备规程[详细]

  2014-07-17 00:00

  期刊论文

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• 高速离心机在细胞复苏实验中的应用

  高速离心机在细胞复苏实验中的应用[详细]

  2024-09-16 03:14

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• 小鼠细胞间粘附分子1试剂盒实验原理

  小鼠细胞间粘附分子1试剂盒实验原理本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中小鼠细胞间粘附分子1（ICAM-1）水平。用纯化的小鼠细胞间粘附分子1（ICAM-1）抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入细胞间粘附分子1（ICAM-1），再与HRP标记的细胞间粘附分子1（ICAM-1）抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成Z终的黄色。颜色的深浅和样品中的细胞间粘附分子1（ICAM-1）呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中小鼠细胞间粘附分子1（ICAM-1）浓度。小鼠细胞间粘附分子1试剂盒组成120倍浓缩洗涤液20ml×1瓶7终止液3ml×1瓶2酶标试剂3ml×1瓶8标准品（320ng/L）0.5ml×1瓶3酶标包被板12孔×4条9标准品稀释液1.5ml×1瓶4样品稀释液3ml×1瓶10说明书1份5显色剂A液3ml×1瓶11封板膜2张6显色剂B液3ml×1/瓶12密封袋1个小鼠细胞间粘附分子1试剂盒操作步骤标准品的稀释：本试剂盒提供原倍标准品一支，用户可按照下列图表在小试管中进行稀释。160ng/L5号标准品150μl的原倍标准品加入150μl标准品稀释液80ng/L4号标准品150μl的5号标准品加入150μl标准品稀释液40ng/L3号标准品150μl的4号标准品加入150μl标准品稀释液20ng/L2号标准品150μl的3号标准品加入150μl标准品稀释液10ng/L1号标准品150μl的2号标准品加入150μl标准品稀释液加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、标准孔、待测样品孔。在酶标包被板上标准品准确加样50μl，待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl（样品Z终稀释度为5倍）。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。加酶：每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外。温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟。洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。显色：每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15分钟.终止：每孔加终止液50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。测定：以空白空调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度（OD值）。测定应在加终止液后15分钟以内进行。[详细]

  2018-10-03 10:00

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• 可燃气体探测器环形配比实验箱产品样册

  可燃气体探测器环形配比实验箱产品样册[详细]

  2016-10-19 18:04

  课件

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• 涡流稳定环形分层火焰特征的实验研究

  涡流稳定环形分层火焰特征的实验研究[详细]

  2024-09-19 15:37

  应用文章

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• FH0050-人大细胞肺癌细胞；NCI-H460

  FH0050-人大细胞肺癌细胞；NCI-H460[详细]

  2024-05-30 09:33

  应用文章

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• FH0049-人大细胞肺癌细胞；NCI-H661

  FH0049-人大细胞肺癌细胞；NCI-H661[详细]

  2024-05-30 09:33

  应用文章

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