核酸电泳参数要求

核酸电泳的关键参数控制与优化指南

在分子生物学实验中，核酸电泳是评估DNA或RNA完整性、浓度及片段大小的基础技术。虽然操作流程看似简单，但若要获得高分辨率、条带清晰且无畸变的实验结果，必须对电场强度、凝胶浓度、缓冲液特性及样品载量等核心参数进行精确控制。

凝胶浓度与片段分离范围的匹配

凝胶的孔径大小直接决定了核酸分子的迁移速率及其分离分辨率。对于琼脂糖凝胶电泳，浓度的选择应基于目标片段的大小。通常情况下，较低浓度的凝胶（0.7%-0.8%）具备较大的孔径，适用于分离5kb至10kb以上的大片段；而高浓度凝胶（2.0%以上）则更适合50bp至500bp的小片段分析。

• 0.5% 琼脂糖： 分离范围 1,000 bp – 30,000 bp
• 0.7% 琼脂糖： 分离范围 800 bp – 12,000 bp
• 1.0% 琼脂糖： 分离范围 500 bp – 10,000 bp
• 1.2% 琼脂糖： 分离范围 400 bp – 7,000 bp
• 1.5% 琼脂糖： 分离范围 200 bp – 3,000 bp
• 2.0% 琼脂糖： 分离范围 50 bp – 2,000 bp

电场强度（V/cm）的设定规范

在电泳过程中，决定核酸迁移率的关键指标是电场强度，即单位电极间距下的电压值（V/cm），而非电源设备上显示的电压。电场强度过高会导致凝胶过热，产生焦耳热效应，引起条带拖尾或凝胶融化；电场强度过低则会因扩散效应导致条带弥散。

对于标准水平电泳，建议的参数如下：

• 常量电泳（标准分辨率）： 1 V/cm - 5 V/cm。此范围能兼顾运行时间与条带锐度，是常规实验的首选。
• 高分辨率电泳（大片段）： 0.5 V/cm - 1 V/cm。降低电压有助于减小长链DNA在迁移过程中的构象扭曲，提升分离精度。
• 快速筛选： 5 V/cm - 10 V/cm。仅适用于短时间运行或对条带要求不高的粗略检测，需注意散热。

缓冲系统的性能权衡：TAE vs. TBE

缓冲液不仅提供导电离子，还起到稳定系统pH值的作用。目前实验室主流使用的缓冲液为TAE（Tris-Acetate-EDTA）和TBE（Tris-Borate-EDTA），两者的物理化学特性决定了其应用场景的差异。

• TAE 缓冲液： 离子强度较低，缓冲容量相对较弱，长时间电泳需更换或循环缓冲液。其优势在于双链DNA在TAE中的迁移率较快，且回收DNA后的后续酶切、连接反应抑制较小，适合制备性电泳。
• TBE 缓冲液： 具有更高的缓冲容量和导电性能。由于硼酸盐能与琼脂糖中的糖类形成复合物，增强了凝胶网络结构，因此在分离小于1kb的片段时，TBE能提供比TAE更高的分辨率。

样品载量与上样体积控制

上样量是影响条带质量的直观因素。单孔上样量过多会导致电泳带超载，出现“抹带”或“U形带”现象；载量不足则会导致信号微弱。

• 最小检出量： 采用EB（溴化乙锭）染色时，单带DNA含量需达到10ng以上方可见光；使用高灵敏度荧光染料（如SYBR Safe）可降低至1-2ng。
• 最大载量： 对于0.5cm宽的上样孔，建议单条带DNA载量不超过50ng-100ng，总DNA载量控制在500ng以内。
• 上样体积： 液体总体积不应超过样孔容积的80%，以防止样品溢出造成孔间交叉污染。

运行环境与温度管理

环境温度对电泳结果的影响往往被忽视。核酸电泳理想的运行温度应维持在15℃至25℃。如果电压设置较高，焦耳热会导致凝胶内部温度升高，不仅会改变核酸的迁移率，还可能导致DNA在电泳过程中发生热变性。对于需要高电压快速分离的实验，建议在4℃恒温室中操作或使用带循环制冷系统的电泳槽，以确保实验结果的重现性与准确性。