核酸电泳基本原理

核酸电泳的核心物理机制：电场驱动下的分子迁移

核酸电泳技术的本质是利用核酸分子在电场中向正极迁移的特性，通过支持介质的“分子筛”效应实现按片段大小分离。核酸分子（DNA/RNA）的磷酸骨架在生理条件下（pH 8.0左右）带负电荷，其电荷量与分子量呈正相关。由于电荷密度基本一致，在自由溶液中不同长度的核酸迁移速率几乎相同。因此，必须引入具有微孔网状结构的介质（如琼脂糖或聚丙烯酰胺），利用孔径对不同尺寸分子的阻力差异，使小片段迁移快、大片段迁移慢，从而达成空间上的分离。

分离介质的选择与性能边界

在实验室应用中，介质的选择直接决定了分离的分辨率。琼脂糖（Agarose）通常用于分离0.1-30 kb的大片段核酸，而聚丙烯酰胺凝胶（PAGE）则凭借其极小的孔径，能够实现单碱基对（1 bp）级别的分辨，多用于短片段分析及测序。

• 0.5% 浓度： 对应分离范围 1.0 – 30 kb
• 0.7% 浓度： 对应分离范围 0.8 – 12 kb
• 1.0% 浓度： 对应分离范围 0.5 – 10 kb
• 1.2% 浓度： 对应分离范围 0.4 – 7 kb
• 1.5% 浓度： 对应分离范围 0.2 – 3 kb
• 2.0% 浓度： 对应分离范围 0.1 – 2 kb

关键影响变量：电压、缓冲液与构象

核酸的迁移率不仅受分子量影响，还受到电场强度、缓冲液离子强度及核酸构象的调节。

1. 电场强度（电压）： 实验通常建议电极间距电压控制在 1–5 V/cm。高电压会加快迁移速度，但会导致凝胶发热，造成条带弥散或核酸变性。
2. 缓冲液系统： 常用的 TAE（Tris-Acetate-EDTA）适用于大片段分离和回收，其迁移速度较快，但缓冲能力较弱；TBE（Tris-Borate-EDTA）则具有更强的缓冲能力和更高的分辨率，适合长时间运行。
3. 分子构象： 对于质粒 DNA 而言，其三种构象在相同电压下的迁移速度通常表现为：超螺旋型（Supercoiled）> 线型（Linear）> 开环型（Open Circular）。这一特性是评估质粒提取完整性的重要指标。

现代检测中的可视化与数字化趋势

传统的核酸电泳依赖于核酸染料（如 EB 及其安全性替代品）的嵌入。染料在紫外或蓝光激发下发出荧光，其强度与核酸含量呈线性相关。随着工业级检测的需求提升，全自动毛细管电泳系统逐渐普及。相比传统平板电泳，毛细管电泳利用极细的石英管和高灵敏度检测器，实现了从手动制胶到数字化结果输出的跨越，不仅提高了灵敏度，更大幅增强了数据的复现性与合规性（如符合 21 CFR Part 11 要求）。

在实际操作中，准确把握凝胶浓度与目标片段的匹配关系，并根据实验目的选择合适的缓冲系统，是获取高质量电泳图谱的前提。对于从业者而言，理解这些基础原理并结合实时设备参数进行优化，是确保科研和工业检测数据真实可靠的核心竞争力。