核酸电泳技术参数

核酸电泳核心技术参数：从原理到实验室实操优化

核酸电泳作为分子生物学实验室的基石技术，其本质是带负电荷的核酸分子在电场驱动下，通过凝胶介质的孔径筛选作用，按分子量大小进行分离的过程。尽管操作看似常规，但分离精度、带型清晰度以及实验的可重复性，高度依赖于对物理与化学参数的控制。

凝胶浓度与片段分辨率的匹配

agarose（琼脂糖）或聚丙烯酰胺的浓度直接决定了凝胶的平均孔径。选择合适的浓度是获得理想条带分辨率的前提。对于常规琼脂糖电泳，浓度与线性DNA的佳分离范围对照如下：

• 0.5% Agarose： 1,000 bp – 30,000 bp (适用于大片段基因组或质粒切割)
• 0.8% Agarose： 800 bp – 12,000 bp (常规PCR产物与质粒检测)
• 1.0% Agarose： 500 bp – 10,000 bp (最通用的检测浓度)
• 1.5% Agarose： 200 bp – 3,000 bp (较小PCR片段及cDNA分析)
• 2.0% Agarose： 50 bp – 2,000 bp (高分辨率需求，如微卫星不稳定性检测)

对于小于100bp的极小片段，建议采用聚丙烯酰胺凝胶（PAGE）或高分辨率等级的琼脂糖。

缓冲体系的选择逻辑：TAE vs. TBE

缓冲液不仅提供导电离子，还起到稳定系统pH值的作用。行业内主流选择集中在TAE（Tris-Acetate-EDTA）与TBE（Tris-Borate-EDTA）之间。

1. TAE (Tris-乙酸盐)：
   • 优点： 离子强度低，对双链DNA的构象影响小，利于回收（Prep级别实验首选）。
   • 缺点： 缓冲容量较弱，长时间电泳会导致阳极酸化，需频繁更换循环。
   
   
2. TBE (Tris-硼酸盐)：
   • 优点： 缓冲能力极强，产生的热量相对较少，对小于1kb的小片段分辨率显著优于TAE。
   • 缺点： 硼酸盐会与琼脂糖中的糖类结合，影响后续的DNA回收效率。
   
   

电场强度与电压设定标准

电场强度（V/cm）是决定核酸迁移速度的核心参数，这里的距离（cm）是指正负电极间的直线距离，而非凝胶本身的长度。

• 标准电泳： 建议设定在 1 - 5 V/cm。
• 高压快跑： 超过 5 V/cm 会导致凝胶内部蓄热（Joule heating），引起条带扩散（Smearing）甚至凝胶熔化。
• 大片段分离： 分离大于20kb的片段时，需降低至 0.5 - 1 V/cm，以减少剪切力对大分子的损伤。

核酸染料的灵敏度与检测限

随着实验室安全意识的提升，传统的EB（溴化乙锭）正逐渐被灵敏度更高、安全性更好的花菁类染料（如GelRed, SYBR Green）取代。

• 灵敏度分级：
  • EB：检测限约 1-5 ng/band。
  • SYBR Green I：检测限可达 60 pg/band（适用于低浓度载体检测）。
  
  
• 添加方式： “内染”（泡在胶里）会略微改变DNA迁移率，尤其在大片段中表现明显；“后染”（跑完再泡）则不会干扰迁移，但操作耗时增加。

影响迁移率的其他关键因子

在实际操作中，以下参数往往被初学者忽视，却是从业者排查故障的关键：

1. 上样量： 单个条带中的核酸量建议控制在 50 - 200 ng。过量会导致电泳道过载，引起条带拖尾或连带。
2. 离子强度： 缓冲液若稀释倍数错误（如误用0.1x TAE），电导率不足会导致条带跑不动或畸形；若浓度过高，则会导致电流激增。
3. DNA构象： 同一大小的质粒，超螺旋（Supercoiled）迁移最快，其次是线型（Linear），开环（Open Circular）最慢。

进阶优化建议

在工业化检测或高精度科研分析中，保持温度恒定是提升一致性的有效手段。在大规模电泳或长时间运行中，建议使用带冷却循环系统的电泳槽。针对AI自动化分析的需求，上样时应确保液面平整，并采用高对比度的成像参数（如特定发射滤光片），以减少背景噪音对自动条带识别算法的干扰。