细胞培养箱的作用

　　细胞培养箱是细胞、组织、细菌培养的一种先进仪器，是开展免疫学、肿瘤学、遗传学及生物工程所必须的关键设备，广泛应用于微生物、农业科学、YL实验等科学研究和生产。

细胞培养的原理

　　将动物机体的各种组织从机体中取出，经各种酶(常用胰蛋白酶)、螯合剂(常用EDTA)或机械方法处理，分散成单细胞，置合适的培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖，这一过程称原代培养。

　　细胞在培养瓶长成致密单层后，已基本上饱和，为使细胞能继续生长，同时也将细胞数量扩大，就必须进行传代(再培养)。传代培养也是一种将细胞种保存下去的方法。同时也是利用培养细胞进行各种实验的必经过程。

为什么细胞培养需要在细胞培养箱中?

　　CO₂既是细胞代谢产物也是细胞所需成分，主要与维持培养液的pH有直接关系。动物细胞多数需要微碱性环境，pH为7.4左右。在细胞培养过程中，随着CO₂释放量的增多，培养基会变酸，因此常加入NaHCO₃来调节pH。NaHCO₃具有释放CO₂的倾向，加入CO₂可以YZ这个反应的进行。

　　细胞培养箱中CO₂浓度应与培养液中NaHCO₃浓度相平衡，细胞培养箱的气体环境一般是95%的空气和5%的CO₂。

　　并非只有细胞培养箱才能做细胞培养，主要是细胞培养箱可以省去很多麻烦。普通的恒温培养箱，生化培养箱也可以做细胞培养。但是要时刻监视溶液中的PH值，湿度，工作量增加很多，失败概率也增大很多。所以细胞培养一般在细胞培养箱中。

细胞的初代培养

　　初代消化培养法：

　　1、准备:取各种已消毒的培养用品置于净化台面，紫外线消毒20分钟。开始工作前先洗手、75%酒精擦拭手至肘部。

　　2、布局:点燃酒精灯，安装吸管帽。

　　3、处理组织:把组织块置于烧杯中，用Hanks液漂洗2~3次，去除血污;如怀疑组织可能污染，可先置于含有青链霉素的混合液中30~60分钟。

　　4、剪切:用眼科剪把组织切成2~3毫米大小的块，以便于消化。加入比组织块总量多30~50倍的胰蛋白酶液，然后一并倒入三角烧瓶中，结扎瓶口或塞以胶塞。

　　5、消化:或用恒温水浴，或置于37℃温箱消化均可，消化中每隔20分钟应摇动一次，如用电磁恒温搅拌器消化更好。消化时间依组织块的大小和组织的硬度而定。

　　6、分离:在消化过程中见消化液发混浊时，可用吸管吸出少许消化液在镜下观察，如组织已分散成细胞团或单个细胞，立即终止消化，随即通过适宜不锈钢筛，滤掉尚未充分消化开的组织块。低速(500~1000转/分)离心消化液5分钟，吸出上清，加入适量含有血清的培养液。

　　7、计数:用计数板计数，如细胞悬液细胞密度过大，再补加培养液调整后，分装入培养瓶中。对大多数细胞来说，pH要求在7.2~7.4范围，培养液呈微红色，如颜色偏黄，说明液体变酸，可用NaHCO3调整。

　　8、培养:置于36.5℃温箱培养，如用CO2温箱培养，瓶口需用纱布棉塞或螺旋帽堵塞，纱布塞易生霉菌，每次换液时需要换新塞。

　　初代组织块培养法：

　　1、剪切:把组织小块置于小烧杯或青霉素小瓶中，用Hanks液漂洗二三次以去掉表面血污，吸静Hanks液，用眼科剪反复剪切1mm3块为止。

　　2、摆布:用弯头吸管吸取若干小块，置于培养瓶中，用吸管弯头把组织小块摆布在培养瓶底部，小块相互距离以0.5cm为宜，每25ml培养瓶底可摆布20~30块。

　　3、轻轻翻转培养瓶，另瓶底向上，注意翻瓶时勿另组织小块流动，塞好瓶塞，置36.5℃温箱培养2小时左右(勿超过4小时)，使小块微干涸。

　　4、培养:从微箱中取出培养瓶，开塞，46度斜持培养瓶，箱瓶底脚部轻轻注入培养液少许，然后缓缓再把培养瓶翻转过来，让培养液慢慢覆盖附于瓶地上的组织小块。置温箱中静止培养。待细胞从组织块游出数量增多后。再补加培养液。

细胞的传代培养

　　1、吸除旧的DMEM培养液：拿出吸管(要拿吸管的上端)，插入与抽滤瓶相连的橡胶管中，在酒精灯外焰灼烧灭菌，细胞培养瓶倾斜将吸管插入瓶底部一角，吸出旧的DMEM培养液，将用后的吸管弃于废弃缸里。

　　2、消化：拿出5mL移液管，酒精灯过火灼烧，吸取2mL0.25%胰酶，混匀，放于37℃孵箱中消化5-6min。取下用后的移液管。

　　3、中和：从孵箱中拿出培养瓶，显微镜下观察细胞是否被完全消化下来，5mL灭菌后移液管加入3mLDMEM培养液终止消化。反复吹打混匀;吸出中和液转移到50mL离心管中。

　　4、离心收集细胞：配平后离心200×g，3min。将新的DMEM培养液加入新培养瓶中，2mL/瓶(培养瓶底面积为25cm²)。

　　5、重悬细胞：离心后吸出中和液，(先吸出表面泡沫，一定注意不要吸出细胞)。加入新DMEM培养液(按2mL/瓶和细胞传代数计算加入的培养液体积)，反复吹打使细胞充分混匀，要尽量减少产生气泡。

　　6、分装：混匀后将细胞分装，按2mL/瓶得体积加入培养瓶中，充分混匀。记号笔标记细胞名称，培养液，细胞传代数，传代日期，实验人员。

　　7、培养：将细胞放于37℃，4%CO₂细胞培养箱培养。将0.25%胰酶，细胞培养液密封好放于4℃冰箱中保存。

　　8、清洁安全柜：实验完毕后，盖灭酒精灯，关闭真空泵，用酒精棉球擦干净操作台表面。

　　9、观察：每天观察细胞，并记录细胞生长状态。

细胞培养的注意事项

　　1、紫外消毒过程中会产生臭氧分子，对人体有害。一般情况下，消毒后至少半小时后再进入。

　　2、所有的实验器材都要经过消毒处理;所有的细胞操作都在安全柜中进行，每一步都要注意不能用手碰到瓶口，培养液不能碰到瓶口，拿培养瓶时要使培养瓶瓶口微微翘起。

　　3、细胞消化时间不能太长，要让细胞尽快脱离不舒服的环境;离心时离心机转速不能太高，实验前要设定好离心转速和时间;重悬细胞时要保证细胞完全混匀，在显微镜下观察细胞是一个一个的。

　　4、传代培养时要注意无菌操作并防止细胞之间的交叉污染。所有操作要尽量靠近酒精灯火焰。每次Z好只进行一种细胞的操作。每一种细胞使用一套器材。培养用液应严格分开。

　　5、每天观察细胞形态，掌握好细胞是否健康的标准：健康细胞的形态饱满，折光性好，生长致密时即可传代。