紫外交联实验原理和步骤

紫外交联仪的主要用途为在膜上交联核酸，其是一种254mm紫外辐射系统，其有很多用途，UV灭菌消除PCR污染、嘧啶二聚体产生的部分限制性内切酶消化、RecA突变筛选以及琼脂糖凝胶中DNA的切割等亦是其用途。其的应用价值也体现在聚合物紫外处理和紫外灭菌等方面。以下为紫外交联实验原理和步骤。

原理：

和非取代的DNA相比较，含有如溴脱氧尿苷胸苷卤代物的DNA对于紫外线诱导的交联有着更高的敏感性。

仪器：

1、紫外透射仪 2、水浴锅  3、 圆底0.5 mL 4、螺旋盖的小瓶

5、DEAE膜

试剂：

14C标记的蛋白质分子质量标记物、Fluor、SDS样品缓冲液×2、1U 微球菌核酸酶、DNA酶I 、CaCl2 0.5 mol/L、大分子载体DNA、经缓冲的含有DNA结合蛋白的提取液、TE缓冲液、1**%乙醇、乙酸铵、25U 大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow片段、二硫苏糖醇 0.lmol/L、dNTP BrdU 溶液×50、[α32P] dCTP 3000 Ci mmol、10×与1×限制性内切核酸酶缓冲液以及M13通用引物17bp。

步骤

1、混合10μL含有高亲和性蛋白结合位点的目的序列的单链M13载体和等摩尔的17 bp M13通用引物，使用1×限制性内切核酸酶缓冲液调节终体积到100μL。在90摄氏度下加热5分钟。在室温下冷却、

2、在杂交混合物中加入Klenow 酶 5μL、水7μL、10×限制性内切核酸酶缓冲液7.5μL、0.1 mol/L 二硫苏糖醇1.75μL、50× dNTP/BrdU 溶液 3.5μL、[α32P] dCTP50μ等反应物，在16摄氏度下温浴90分钟。

3、在68摄氏度下加热10分钟，将Klenow 酶灭活。

4、使用40U限制性内切核酸酶在合适条件下消化，使得20600 bp的DNA片段产生。

5、将乙酸铵添加到0.3 mol/L，DNA使用2倍体积的1**%乙醇进行沉淀，在TE缓冲液中重悬。

6、电泳在含有0.5μg/mL溴化乙锭的琼脂糖凝胶上进行。所要的DNA片段使用DEAE膜进行分离。

7、BrdU取代的DNA片段的特异活性使用闪烁计数器进行检测，DNA的浓度的估计采用溴化乙锭点迹定量法。能够采用迁移率变动DNA结合分析法来检测探针的完整性和功能。

8、将下列结合反应建立于1.5 mL圆底小瓶中：将10-20μg DNA 载体、经缓冲的含有结合蛋白的提取液以及105cpm均衡标记的探针混合，调节总体积到50μL。瓶口使用塑料薄膜封住，固定再采用Parafilm膜加封。

9、在试管架上放上小瓶，于正上方5厘米处使用倒置的紫外透射灯照射1个小时。

10、将1U微球菌核酸酶、DNA 酶 I 4μg、0.5 mol/L CaCl2 1μL等反应物加入到各结合反应管中，在37摄氏度下消化半个小时。

11、在反应混合物中加入等体积的2×SDS样品缓冲液，在100摄氏度中煮沸5分钟。

12、样品的电泳在适当浓度的不连续SDS-聚丙烯酰胺凝胶上进行。

13、完成电泳之后，将凝胶前沿的染料切去。

14、干胶，使用增感屏放射自显影13日，来对交联的蛋白质进行观测。