细胞培养的步骤和设施器材

细胞培养指的是在体外模拟体内的环境（无菌、适宜温度、酸碱度和一定营养条件等），让它生存、生长、繁殖并且能够维持主要的结构和功能的一种方法。细胞培养在生物学中又叫做细胞培养技术。不论对于整个生物工程技术，还是其中之一的生物克隆技术来说，细胞培养技术可以通过一个细胞培养成为大量的单细胞或极少分化的多细胞，细胞培养技术是细胞生物学研究方法中及其重要和常见的技术，由细胞培养不仅能够获取大量细胞，还能够借此研究细胞其他的相关知识。

一、细胞复苏

将冻存细胞从液氮中取出后，在37℃水浴锅内不断摇动促进其融化。移入15ml离心管中，加入10ml预热的DMEM完全培养基，轻轻吹匀，离心，2000rpmX2min，弃上清液。加入10ml DMEM培养基清洗，弃上清液。加入10ml DMEM完全培养基，轻轻吹打，接种于10cm盘中，在含5%CO2的细胞培养箱中培养。

二、细胞传代

细胞密度达到80%~90%时．去培养基，10ml PBS清洗2次。加入3ml含0．25%EDTA的胰蛋白酶，放入细胞培养箱3min。加人1ml DMEM完全培养基终止胰酶消化，转移至15ml离心管。加入10ml PBS清洗细胞培养盘，转移至15ml离心管，2000rpmX2min，弃上清液。再加入10ml PBS（经高压灭菌，保存于40C），吹匀，吸取10微升进行计数，按照1×105/盘接种，在含5%CO2的细胞培养箱继续培养。

三、细胞冻存

细胞密度达到80%～90%时，去培养基，10ml PBS清洗2次。加入3ml含0.25%EDTA的胰蛋白酶，放入细胞培养箱3min。加入lmlDMEM完全培养基终止胰酶消化，转移至15ml离心管。加入10ml PBS清洗细胞培养盘，转移至15ml离心管，2000rpmX2min，弃上清液。加入lml冻存液（90%血清，10%DMSO），放入冻存盒内（盒内有异丙醇，以保证温度降低的速度），立即放入一80℃冰箱内，过夜，第二天放入液氮中，可以保存至少两年，如不放入液氮，可以保存三个月。

冻存液的配制：70%的完全培养基+20%FBS+10%DMSO.DMSO要慢慢滴加，边滴边摇。

设施：超净台、恒温培养箱、倒置显微镜、液氮储存罐、电热鼓风干燥箱、冰柜、电子天平、恒温水浴槽、离心机、压力蒸汽消毒器。

器材：

一、玻璃器材

培养皿、滴流瓶、刻度吸管、离心管、培养瓶、烧杯、量筒、三角烧瓶

二、塑料器材

多孔培养板、培养皿、培养瓶

三、橡皮器材

橡皮制品（Z好是硅制品）做各种瓶或试管的塞子、盖子。

四、金属器材

剪刀、镊子、手术刀、解剖刀、血管钳、组织镊、眼科镊及各种型号针头

五、其他物品

纱布、注射器和针头