PCR方法

PCR是聚合酶链式反应的简称，是一种酶促化学反应，可以在试管里将待测的目的基因在很短的时间内扩增五十万倍乃至上百万倍，大大提高了基因诊断的灵敏度，降低了分析的难度。PCR法是目前基因诊断中使用Z多的方法。现在已经发展到第三代PCR技术了：采用琼脂糖电泳的方式对PCR产物进行分析的diyi代PCR， 荧光定量实PCR的第二代PCR，以微滴化处理步骤为主要特征的第三代PCR技术。下面就让小编带你了解一下PCR的方法。

试剂

引物：扩增的特异性由其决定。按照检测的DNA的差异，选择不一样的引物。每种病原微生物均有其特异的引物。

耐热的DNA聚合酶：从耐热细菌中分离出此酶，此酶能够耐受高温90℃-100℃。

10×PCR缓冲液：1mg/ml 明胶、150mmol/L MgCl2、100mmol/L Tris-HCl(pH8.4,20℃)、500mmol/l KCl。

5mmol/L dNTP贮备液：合并dATP、dCTP、dGTP和dTTP钠盐各100mg，溶解于灭菌去离子水中，使用NaOH将pH调至中性，每份分装300μl，在温度-20℃下保存。Z好用UV吸收法精确测定dNTP浓度。

DNA模板：使用处理液处理待测标本，处理方法各异，操作也不相同，然而都是将标本中被检测的DNA暴露的目的。

操作

在一微量离心管中分别加入PCR必需反应成份，然后一定的循环参数条件下进行循环扩增为过去标准的PCR操作。操作如下：

1.将102-105拷贝DNA模板、引物各1μmol/L、dNTP1/10体积、10×PCR缓冲液各200μmol/L、ddH2O补到终体积（终体积50μl-100μl）加入到一微量离心管中混匀后，离心15s在管底让反应成分集中。

2.为了避免蒸发。在反应液表面加50-100μl石蜡油，将反应管放在97℃下变性10分钟。

3.将温度冷却至延伸温度，将1-5u Taq DNA聚合酶加入，离心30s充分混合酶和反应液充分。

4.在温度94℃下变性30s，5555℃退火20s，然后在72℃延伸30s，共循环30-35次。Z后一次循环结束后，再将反应管置72℃温育5min，以确保充分延伸。