光纤记录详解，一文带你详细了解光纤记录实验！

一、光纤记录工作原理

人类的大脑拥有约900亿个神经元，神经元之间通过突触相互连接形成了复杂的神经网络，并由此产生各种复杂的功能。大脑能够合成和释放上百种神经递质，神经信号通过突触释放的神经递质从而在神经元之间进行传递（图1）。

图1

当神经兴奋传导到突触末端时，会刺激突触上钙离子通道打开促使钙离子大量内流，胞内钙离子浓度瞬时上升，驱动突触小泡将神经递质释放到突触间隙中，释放出的神经递质随即与突触后膜上的受体结合，将递质信号传递给下一个神经元，从而进行信息的逐级传递（图2）。这些神经元以复杂的通路投射到多个脑区，产生了学习认知、情感、控制、动机、奖励等丰富的功能。光纤记录系统则可以通过检测钙离子和神经递质的荧光变化程度来表征群体神经元的活动情况。

图2

那么光纤记录是如何检测神经活动的呢？

以钙离子荧光信号检测为例，光纤记录系统的技术原理是借助钙离子浓度变化与神经元活动之间的严格对应关系，利用特殊的荧光染料或者蛋白质荧光探针，将神经元中钙离子的浓度通过荧光强度表现出来，并被光纤记录系统捕捉，从而达到检测神经元活动的目的。

在神经系统中，静息状态时神经元胞内钙离子浓度为50-100nM，而在神经元兴奋时胞内钙离子浓度能上升10-100倍，因此我们可以通过注射钙离子基因编码指示剂（Calcium indicator，如GCaMPs、RCaMPs等）来标记钙离子。钙离子指示剂带有荧光蛋白（如GFP、RFP等）及其变异体的蛋白质，可与钙调蛋白（CaM）和肌球蛋白轻链激酶M13域结合（图3左）。当神经活动增强时钙离子通道打开，大量钙离子内流并与CaM结合，导致M13和CaM结构域相互作用，引发cpEGFP结构重排，从而增强绿色荧光信号（图3 右）。

因此我们可以通过检测钙信号的变化来表征神经元的活动，进而研究神经元活动与动物行为的相关性，探究复杂行为背后的调控机制。

图3

(Marisela Morales, et al. Neuron, 2020)

图4：VTA-VGluT2神经元编码先天逃避反应

光纤记录检测神经递质信号的原理与上述方法相同，把cpEGFP嵌入特定的神经递质受体，受体与神经递质结合后会引发受体构象改变并发出荧光信号（图5）。通过病毒注射、转染等技术手段，可以将这种可遗传编码的探针表达在细胞或小鼠脑部，借助成像技术，观察神经递质浓度的实时变化。

图5

(Yulong Li, et al. Cell, 2018)

图6：条件反射实验中伏隔核Nac脑区的DA释放

二、光纤记录实验方法

在光纤记录实验中，首先要选择合适的荧光病毒。荧光染料或指示剂是通过病毒载体转入目标脑区，常用载体为AAV病毒。根据实验的不同，需要选择特异启动子或者Cre-FloxP系统来特异标记目标神经元，无特异性的GCaMPs表达虽然可以观测群体神经元活动但无神经元特异性，光纤记录的作用在于观测特异类型神经元群体的活动。

实验流程：

1、在目标脑区注射钙荧光病毒，并在注射位点埋植光纤插针，用于收集荧光；

图7：病毒注射与陶瓷插针埋植

2、待2-3周钙荧光病毒表达后，连接光纤，使用光纤记录系统采集动物在行为学实验中大脑的钙荧光信号；

图8：病毒表达

3、通过分析软件处理钙荧光信号数据，并结合行为学视频对动物的行为进行分析。

图9：光纤记录结合高架十字迷宫实验

三、光纤记录数据分析

以瑞沃德R820三色光纤记录系统记录的数据为例。

1、数据预处理。R820三色光纤记录系统软件集信号采集与数据分析于一体，在数据分析中，数据预处理过程包含平滑处理，基线矫正，运动矫正等功能。

平滑处理可以将数据中的过多杂信号去除，Z大限度的突出目标peak。基线矫正多数针对的是荧光信号因长时间记录导致漂白信号逐步下降，或者光纤的自发荧光在长期记录下逐步被漂白基线逐步下降等情况。此情形的数据因为整体呈现下降趋势，不利于后续数据作图分析，所以需要进行基线矫正。运动矫正用于采用410nm对照通道的数据，410nm数据可以用于反应背景噪音信号，运动矫正即将410nm数据与470nm数据进行拟合，通过算法从470数据中去除410nm数据的波动，得到真实的荧光数据。

图10：光纤记录数据预处理

2. 将荧光数据与动物行为数据同步对比，选择事件标记或者增加事件标记，事件相关信号分析作图。

图11：事件分析

3. 将不同组的数据进行组间对比，即可分析不同处理因素下荧光数据的差异。此外，还可结合行为学视频同步分析动物的运动轨迹。

图12：不同数据组间分析

通过以上步骤，原始的荧光数据就可以直接出图啦。

光纤记录实验的工作原理，实验方法以及数据分析已经全部讲完啦….

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