重组蛋白纯化过程三大挑战与应对思路

01蛋白稳定性不佳

部分重组蛋白自身存在表面疏水区暴露、N/C端容易被蛋白酶破坏等问题，导致蛋白质易产生聚集和降解等情况。同时在下游工艺过程中，不合适的工艺条件（如过高的剪切力、过高的盐浓度、极端pH等）也会导致蛋白沉淀与失活。

蛋白质的物理和化学降解途径及分析方法^【2】

在下游纯化前，通过对样品进行稳定性预实验，可以提前判断样品在不同环境下的稳定性，消除不合适的工艺条件对蛋白产生的不利影响；

在纯化过程中，可以通过对样品进行在线稀释或样品调节的方式，尽可能降低蛋白质处于高浓度、高盐或特定pH环境下的停留时长，提高样品的稳定性；

针对疏水层析等高盐浓度的上样条件，可以在样品调节后通过0.45或0.2 μm滤器过滤的方式去除不溶性颗粒，避免对蛋白沉淀对层析柱的堵塞及污染，可以增加层析柱的使用寿命。

通过前期研究发现，蛋白M容易在较高蛋白浓度或长期处于室温环境下发生C端缺失的现象。由于第一步层析过程中增大了上样载量，导致层析洗脱液中的蛋白浓度增加，使得洗脱样品的稳定性降低。为了避免高样品浓度的影响，通过对洗脱样品进行在线稀释，降低了蛋白浓度，同时在洗脱液收集完毕后迅速转移至2-8度冰箱储存，降低了样品降解的风险。

02层析工艺开发困难

在层析工艺开发过程中，会涉及至少2-3步层析步骤，而且纯化质量结果易受上游来料不同、工艺载量变化等因素影响，导致层析洗脱液杂质水平超标或层析回收率偏低。

在下游层析工艺开发的过程中，工艺参数之间又容易存在交互作用，参数之间互相牵制，难以快速优化得到双赢的工艺参数条件。

针对复杂的层析工艺，可通过QbD的理念，采用实验设计（DoE）或机理建模等手段对层析工艺进行建模。利用模型，可以快速找到双赢的工艺参数，同时也可以帮助评估后续放大规模或料液发生变化的条件下对层析结果的潜在影响，降低工艺线性放大失败的风险。

在蛋白M项目过程中，Fast Trak中国下游团队通过实验设计的方法建立了第一步层析的DoE数理模型，通过数理模型进行工艺优化，在更高的工艺载量下将第一步层析后样品的HCP水平降低了6倍，回收率也提高了20%。

而针对于第二步层析，采用Gosilico机理建模的技术，通过三次流体力学表征实验与四次模型校准实验建立了机理模型，借助模型结果优化了第二步层析的淋洗及洗脱条件，SEC-HPLC纯度由91%提高到了98%。质量大幅度提高的同时还提升了回收率，降本增效的实际产出赢得客户深深的认可。

Fast Trak下游团队依此开发的纯化工艺在1.5个月内完成了3批大规模GMP生产，质量完美达标，同时速度也远远超过客户的预期。

03工艺放大困难

放大时上游料液发生改变导致纯化工艺无法达到小试的质量结果；工艺开发时采用了不适宜放大的工艺单元操作，导致工艺处理时长增加或产品质量不达标风险增大等问题。

在工艺开发时采用不同批次的上游物料测试纯化工艺的稳健性，评估纯化工艺对杂质的去除能力，确保工艺设计留有余量；

层析工艺开发时应尽量使用等度梯度洗脱代替线性梯度洗脱，增加杂质与目标蛋白的分离度，同时避免采取切峰收集等手段；

在工艺开发时对工艺放大之后的规模、成本及可放大性进行评估，选取合适的单元操作步骤。

在蛋白M工艺开发过程中，采取PDD1滤器进行深层过滤的方式代替原工艺中批次离心的操作，将放大后工艺处理时长由5个小时降低到了1个小时，增加了放大后工艺的操作便捷性，同时也进一步使样品浊度降低到了10 NTU以下，避免了高浊度料液对层析柱的污染。

在层析工艺开发时，利用数理/机理建模的工具在两步层析中均成功地优化了等度淋洗与等度洗脱条件，提高了杂质的去除能力，降低了工艺放大时的风险。