【Application Note】改性氨基酸的纯化：ACCQPrep®制备型HPLC系统的应用初探

摘要

本应用报告探讨了使用ACCQPrep制备型HPLC系统纯化一个改性苏氨酸氨基酸。该氨基酸通过侦察运行和"聚焦梯度"功能被成功纯化，并将用于后续的固相多肽合成步骤。

背景

人类细胞表面装饰着大量复杂的碳水化合物分子，即聚糖类，它们在调节各种生物过程中发挥着重要作用。在一个叫做蛋白质糖基化的过程中，聚糖经常与蛋白质相链。人类蛋白质糖基化的一种形式涉及到用甘露糖修饰丝氨酸和苏氨酸残基，并进一步扩展为不同复杂度和长度的几种不同的糖结构。由于糖在先天性肌肉萎缩症和拉萨病毒感染中参与，人们对这一领域的兴趣越来越大，但对它们的了解仍然相对较少。特别是，如果我们要充分了解糖类在细胞生理学和人类疾病中的作用，就需要解决有关其生物合成的重要问题。在这个项目中，我们的目标是用化学方法合成一系列的糖肽，这些糖肽来自于一种天然存在的甘露糖基化的糖蛋白。作为化学工具来研究参与这些糖类生物合成的一组糖基转移酶的活性和底物特异性。要采取的方法包括合成不同长度的多肽，在通常发生糖基化的部位用叠氮化物进行修饰，然后通过点击化学的方式与各种合成的烷基标记的寡糖构建体进行耦合。

实验

此实验仅对合成的叠氮标记氨基酸使用ACCQPrep HPLC系统进行纯化（见方案1）。

Z 后阶段是在小规模内进行的，原因是对羧酸末端的脱保护存在问题，而羧酸末端是用甲酯保护的。用这种氨基酸进行纯化后的固相多肽合成，发现该氨基酸仍然受到甲酯的保护。

方法开发和纯化

将80.1mg的粗品溶解在3mL 1:1的乙腈/水中，在Prep HPLC上使用相同的溶剂系统(这得到了26.7mg/mL的粗制溶液)。Z初的侦测运行使用了0.20mL(5.34mg)的进样，ELSD检测器和紫外检测波长在220nm和280nm的试探运行和聚焦梯度运行都使用了20mmx150mm 5µm C18 AQ柱。

方案1. 叠氮标记的苏氨酸的合成方案。不幸的是，在对SPPS蛋白进行分析后，我们发现Z 后的脱保护步骤是不成功的。

图1.在ACCQPrep高效液相色谱系统上用C18 AQ柱进行的侦探梯度运行。图2和图3中的聚焦梯度使用这个运行结果生成的。

图2.使用C18 AQ柱，从图1中的侦测运行中创建的聚焦的梯度结果。

事实证明，侦察运行本身就能有效的将产品与杂质分离开来，从中可以使用 "聚焦梯度 "功能，聚焦于~6.5mins 时洗脱的峰。同样的样品和进样量（0.20mL/5.34mg）被用于这些运行，以及后续运行以分离剩余的粗制样品 。

这使得12分钟内的梯度从45%到65%的乙腈，然后在5.3 分钟内达到100%的乙腈，以洗出柱子上的任何剩余化合物。目标化合物在7.6分钟时洗脱，形成一个窄峰。由于氨基酸上有Fmoc保护基，所以有明显的紫外吸收。然而，可以通过使用更大的进样量或增加ELSD的增益来纠正ELDS信号弱的情况。该化合物的熔点估计为接近于90℃。这很重要，因为熔点已被证明会影响ELSD的检测。1使用水-乙腈梯度，发现熔点低于90 °C的化合物的灵敏度下降。

图3.同样的聚焦梯度和样品量，但用掺有0.1%甲酸的MeCN/H2O进行检测。第二个峰已经分离成两个峰，这表明杂质的分离效果更好。

聚焦梯度运行采用了相同的溶剂系统，乙腈和水都掺入了0.1%的甲酸。色谱显示成功的分离了所需的化合物，但在10.8分钟左右的第二个杂质峰似乎被更好的分离，这表现一个新峰的出现。然而，由于样品量小，系统没有将这两个峰回收到试管中。同样，如果注入更多的样品，这个问题可以得到纠正，并且可以回收这些杂质进行鉴定。紫外检测器的增益也可以增加，或者降低阈值来收集这些峰。聚焦梯度发生器的使用限制了运行时间，因此可以使用 "全部收集 " 来收集所有的东西，同时还可以切割较大的峰。 

总结

使用C18 AQ柱反相纯化氨基酸被证明是成功的，紫外检测器有助于识别紫外活性的Fmoc保护基。ELSD检测器的强度不足可以通过注入更多的粗制样品进行纯化来纠正，这样可以节省纯化整个样品的时间。