NGS核酸纯化之洗脱篇：用啥洗？加多少？洗多久？加热吗？

贝克曼库尔特基于SPRI技术的AMPure XP及SPRIselect两种NGS文库纯化和片筛试剂已家喻户晓。该技术采用顺磁性的磁珠、选择性的结合特定大小的核酸，被众多主流建库试剂盒及测序专家指定选用。

那么，“金标准”还有优化的空间吗？让原厂来给您专业的分析：单从洗脱，有哪些优化的重 点。

用什么洗？

如上图所示: 在Tris or TE buffer (+/-EDTA)中，洗脱得率相比于纯水有了显著提升。而PBS溶液（pH 6-8）的效果紧随其后，且PH无显著影响。这可能与PBS中的盐离子的存在有关。另一方面，从稳定性（CV）上看，Tris\TE\PBS洗脱都优于水。

如上图所示：对比了不同加样体积及洗脱体积的影响。所有的DNA起始浓度一致，因此洗脱体积越小，产物相对浓度越高 (A)；但是由于磁珠也会占用一部分洗脱溶液的体积（约1 µL），产物浓度越高则这部分损失越多(B)；虽然小体积洗脱会得到影响核酸的得率，但是这并不是因为洗脱效率引起的：当投入量一致时，不同洗脱体积的得率无显著差异(C)。

洗多久？加热吗？

如上图所示：在1分钟的时候，洗脱已经进入平台期（非指数期）提示大多数核酸已经洗脱下来。不加热的情况下，1分钟与20分钟洗脱相比，1分钟的量显著偏低（p < 0.01)。从2分钟洗脱开始，无显著差异。加热至60度后，洗脱速度更快：1分钟与其他时长无显著差异。

小结

上述实验通过使用lambda phage DNA (49 kb)，对贝克曼库尔特的SPRI技术磁珠进行测试，提示：

• 长达49 kb的核酸片段2分钟可以被充分洗脱。

• 使用Tris溶液可以提升洗脱效率和稳定性。

• 不同的起始及洗脱体积对洗脱效率影响不大。

• 但是小体积的物理限制会导致更多核酸损失于死体积。