离子淌度质谱法对N-糖肽唾液酸连接异构体的相对定量

糖蛋白表面的唾液酸修饰在多种病理过程中发挥重要作用，尽管基于质谱(MS)的唾液酸化N-糖肽连接特异性分析正在迅速发展，但这些异构体的定量分析仍然是一个挑战。

近期复旦大学的封晓晓、魏黎明和陆豪杰老师在《Analytical Chemistry》上发表了一篇题为 《Relative Quantification of N‑Glycopeptide Sialic Acid Linkage Isomers by Ion Mobility Mass Spectrometry》的研究论文，报告了一种新颖的定量策略，使用离子淌度质谱(IM-MS)准确鉴定和相对定量了连接特异性的N-糖肽。该方法无需衍生化，可通过IM-MS中的特征碎片离子对完整糖肽的唾液酸异构体进行相对定量，并且该方法在2个数量级的动态范围内具有良好线性(R2 > 0.99)和高重现性(变异系数(CV) <10%，n = 3)。最 后，该方法应用于肝癌(HCC)中结合珠蛋白(Hp)的异常唾液酸化研究，实验结果表明与健康对照组(n = 27)相比，发现HCC病患组(n = 27)中有七条N-糖肽的α2、3与α2、6唾液酸化的比率发生显著改变(p < 0.01)，这种策略有可能用于临床的新型诊断生物标志物的发现。

01实验方法

样品制备

血清经离心和过HiTrap(GE Healthcare)柱后，获得纯化的Hp。纯化后的Hp经变性还原烷基化后，用Trypsin和Glu-C顺序酶切，并使用亲水相互作用液相色谱 (HILIC) 富集N-糖肽。旋干后备用。

LC−MS/MS实验条件

使用M-Class和Waters SYNAPT G2-Si QTof质谱仪连接nano CSH C18,1.7 μm, 75 μm × 150 mm色谱柱进行N-糖肽的反相分析。离子源和去溶剂化温度分别为100和250 °C，毛细管和锥孔电压分别为2.2 kV和30 V。MS扫描范围从m/z100到2,000。对Top15离子进行MS/MS 扫描。质量范围从m/z300到2,000，扫描时间0.2 s。

通过Byonic获得N-糖肽列表后，进行IM-MS分析。四极杆根据保留时间和 m/z窗口(±2 Da)选择目标N-糖肽。

02实验结果

使用IM-MS对N-糖肽α2,3-和α2,6-唾液酸连接异构体进行相对定量的原理

如图1所示，N-糖肽α2,3-和α2,6-唾液酸连接异构体的相对定量方法包含两针连续进样。第 一针使用LC-MS/MS鉴定N-糖肽（图1a），同时记录N-糖肽m/z和保留时间，生成目标唾液酸化N-糖肽列表。第二针对目标N-糖肽进行LC-CID-IM-MS（图1b）分析，根据B3碎片离子(m/z 657.24)对N-糖肽α2,3-和α2,6-连接唾液酸进行相对定量。首先，四极杆根据保留时间和特定的m/z窗口选择目标N-糖肽，经过CID碎裂后，由IM-MS分离并检测碎片离子，其中B3碎片离子(m/z 657.24)呈现出两种不同的到达时间分布(ATD)，两个峰分别对应NeuAcα2-6Galβ1-4GlcNAc和NeuAcα2-3Galβ1-4GlcNAc。文中测量了B3碎片离子的到达时间分布曲线下的面积，用于N-糖肽α2,3与α2,6唾液酸化的相对定量。

图1. IM-MS对完整N-糖肽的α2,3-和α2,6-连接唾液酸进行相对定量的工作流程(a. LC-MS/MS鉴定血清Hp中N-糖肽；b. LC CID-IM-MS测定N-糖肽α2,3与α2,6唾液酸化的比率) 。

Hp蛋白 N-糖肽α2,3-和α2,6-唾液酸连接异构体的综合表征

Hp的β链上有四个糖基化修饰位点（N184、N207、N211和N241），用LC-MS/MS鉴定N-糖肽后，使用LC-CID-IM-MS单独分析67种唾液酸化N-糖肽（图2）。发现相同糖基化位点，随着唾液酸残基增加，α2,3/α2,6比率有增多的趋势，其中单唾液酸化N-糖肽的α2,3/α2,6比率介于0到0.17之间，双唾液酸化和三唾液酸化N-糖肽的α2,3/α2,6比率分别介于0到0.49和0.17到1.4之间。

图2. Hp N-糖肽α2,3-和α2,6-连接唾液酸的综合表征。N-糖肽的组成和α2,3与α2,6唾液酸化的相应比例在每列上方显示。

当以位点特异性方式研究唾液酸化时，发现同一糖型在不同位点的α2,3/α2,6比率也不同。图3a-c是三种同糖型（H6N5S3）不同位点的MS/MS谱图，图3e-f是相应的B3碎片离子IM-MS谱图。其中，N184位点上H6N5S3的α2,3 /α2,6唾液酸化比率为0.23，而N207和N241位点上H6N5S3的α2,3 /α2,6唾液酸化比率分别为0.50和0.64。表明Hp各个位点的α2,3 /α2,6唾液酸化比率可能与糖链谱有差别，说明位点特异性异构体的分析是很有必要的。

图3. 唾液酸化N-糖肽的质谱图。a. MVSHHN184LTTGATLINE_H6N5S3 (母离子 m/z 1533.63); b. NLFLN207HSE_H6N5S3 (母离子m/z 1377.88) 和 c.  VVLHPN241YSQVD_H6N5S3 (母离子m/z 1278.83)。每个N-糖肽的B3碎片的ATD显示在图 d-f 中。所有糖肽母离子电荷均为z = 3。

发现HCC血清生物标志物的应用

为了发现可用于诊断HCC的潜在候选生物标志物，文中比较了健康对照组和HCC患者组的Hp N-糖肽α2,3-/α2,6-唾液酸比率。首先使用LC-MS/MS分别分析HCC与健康人混合血清样品，总共鉴定到137条N-糖肽，其中42条唾液酸化N-糖肽在HCC患者组和健康对照组中均可检测到，被用于测定α2,3/α2,6唾液酸比率。采用正交偏最 小二乘法判别分析OPLS-DA (VIP > 1)和Student t检验(p < 0.05)两种统计方法，发现了9条差异N-糖肽（图4）。

图4. 健康对照组和HCC患者组中的差异Hp N-糖肽的B3碎片 (α2,3/α2,6) 在 ATD下的面积比。误差棒表示四个技术重复的标准偏差。仅显示了统计学上的显著差异糖肽。* 表示p值<0.05，** 表示p值<0.01，*** 表示p值<0.001。

如图4所示，该方法在测定复杂样品中N-糖肽α2,3 /α2,6唾液酸化比率中高度可靠，CV值都在20%以内。此外，α2,3/α2,6比率不但表现出位点占有差异，并且在健康对照组和HCC患者组中具有统计学差异。以岩藻糖基化双天线唾液酸化糖型(H5N4F1S2)在位点N184、N207和N241处的α2,3/α2,6唾液酸化比率为例，与健康对照组相比，HCC患者组中均上调。另外，还观察到HCC患者组中某些糖肽的α2,3/α2,6比率下调，如位点N184处的H6N5S3，以及位点N207处的H5N4F1S1、H5N4S2和H6N5S3。

图5. N-糖肽的α2、3与α2、6 唾液酸化比例的改变。(a) 27个健康个体（蓝点）和 27 个 HCC 个体(红点)之间 7 条N-糖肽的比率（α2、3/α2、6），p 值通过学生t检验计算。(b) 七条唾液酸化N-糖肽生物标志物组合的接受者操作特征 (ROC) 曲线，以及每条N-糖肽的AUC值。每个点代表一个生物重复。** 表示p值< 0.01；*** 表示p 值<0.001。

进一步实验用以测试在个体分析时是否仍然存在这种差异。在另外27名健康个体和27名HCC患者之间比较了9条唾液酸化N-糖肽的比率(图 5a)。在54个样本中，发现7条N糖肽的唾液酸化比率在健康个体和 HCC 患者之间发生显著变化(p<0.01)。

此外，还对HCC的潜在诊断进行了接受者操作特征(ROC)测试和逻辑回归(LR)分析(图5b)。共发现了七种具有高AUC(0.730-0.824) 的潜在N-糖肽唾液酸连接异构体，其最 佳预测标志物是N184位的H5N4F1S2(AUC 0.824)。所有这些都表明，这种策略有可能发现一种可用于临床的新型诊断生物标志物。

03小结

本研究开发了一种使用IM-MS测定位点特异性N-糖肽α2,3 /α2,6唾液酸化比率的方法。该方法可以成功分离和相对定量α2,3-和α2,6-唾液酸连接异构体。无需衍生化操作，可避免额外的预处理引入实验误差。同时，它能够在位点特异性水平稳定、准确地测定α2,3 /α2,6唾液酸化比率。最 后，该方法有应用于癌症生物标志物发现和临床研究的潜力。