荧光光谱表征量子点教程 |技术进阶

编辑：Sophie

校阅：Norah

量子点是一种纳米级别的半导体材料，也被称为一种“人工原子”，它一般为球形或类球形，直径常在2-20 nm之间。量子点的尺寸效应赋予了它半导体特性和光致发光性能，包括优良的荧光标记特征和光化学稳定性，这些特质使它在生物化学、医学诊断、药物筛选、制备发光材料等研究领域中有极大的应用前景。

图1：浙大彭笑刚教授团队研发的量子点发光材料来源：http://nb.ifeng.com/a/20170418/5585065_0.shtml

量子点 

生物成像领域的“实力选手”

开篇中我们提到量子点的众多应用，其中最为瞩目的应用，当属在生物学中作为光致发光标记物、对生物细胞的结构或活动进行荧光检测和细胞成像。

为何量子点在生物成像领域有如此出色的应用潜力呢？

这主要是因为通过调节量子点的成分和尺寸，我们可以改变它的发光波长，进而控制其发出不同颜色的荧光。根据这一特性，可以将量子点作为一种新型检测探针，从而使单分子和单粒子检测成为可能，并给标记分析法带来了数个数量级的变化。

不仅如此，相比于生物成像领域通常使用的有机荧光染料，量子点荧光寿命长，成像时不易发生光漂白，且不同尺寸大小的量子点可以采用单一波长的光激发而发射出不同颜色的荧光，不像有机荧光染料需要特定波长的激发光源激发才能发光。

图2：荧光染料

来源：http://www.jijitang.com/article/5683c1193bbdeaff07109cfb

正是因为量子点的如此多的优点，近年来量子点在生物成像领域的应用成为科研人员关注的重 点。

荧光光谱 

发光性能表征的“绝 佳武器”

虽然量子点在生物成像领域具有如此大的潜力，但要想提升量子点性能却不是一件容易的事情，研究人员们要对量子点的荧光强度、发光寿命、新量子点的合成等问题进行分析，如何将合成的量子点应用于临床也是研究重 点 。

而要解决这些问题，一个重要环节就是对量子点进行表征，即对量子点的发光性能进行评估。

目前有很多种方法来分析量子点，但对于应用于生物成像领域的量子点来说，荧光光谱检测是最为基本的。不止如此，随着荧光光谱分析技术的进步，它具有的灵敏度高、无破坏性和选择性好等等优势，也让荧光光谱技术成为表征量子点表征的优先选择，从而为开发更高性能的量子点提供了可能。

那么，接下来，就让我们进一步了解如何利用荧光光谱对量子点进行表征。话不多说，上干货！

如何操作？  

手把手教你进行性能表征

011、样本准备

首先将量子点样品原液用PBS稀释100倍后超声5分钟，然后再稀释4倍，总稀释倍数为400倍。接着将准备好的样品加入到1厘米石英比色皿中，进行发光性质检测。

图3. 实验流程图

022、A-TEEM™光谱检测

使用具有超快和超灵敏CCD技术的Duetta 同步吸收-荧光光谱仪，来检测量子点的A-TEEM™光谱。将激发光谱测试范围设置为300-700nm，以覆盖整个可见光范围，积分时间设置为0.1秒，使用CCD阵列探测器采集光谱信号，激发和发射端都选择3nm的带宽。

采集完成后软件可自动进行内滤效应校正，获得荧光光谱结果。通过获得的A-TEEM™光谱，我们发现该样品的荧光发射峰在655 nm处（图4），并且发射峰不随激发波长的变化而变化。由此可见，不同于普通有机荧光染料需要特定波长的激发光源才能发光，极宽的吸收峰使得其在655 nm以下的波长范围内都能被激发，这也验证了量子点的应用优势。

图4  A为量子点的吸收光谱（蓝色）和荧光光谱（红色），

B图为A-TEEM™光谱。可以看出：该量子点样品

具备极宽的吸收峰，对激发波光的要求也较低 

TIP: Duetta同步吸收-荧光光谱仪将荧光光谱仪和吸收光谱仪合二为一，比传统光谱仪增加了同步吸收功能，不仅为我们提供了更多分子信息，同时扩展了浓度检测范围，而且能够获得更准确的组分分析。

033、荧光寿命检测

在生物成像时，量子点的荧光寿命长，可使得光激发后样品的自发荧光衰变，而量子点荧光依然存在，从而得到无背景干扰的荧光信号。

根据这一特性，研究人员利用HORIBA DeltaPro 荧光光谱仪对样品进行表征，得到了荧光衰减曲线 (图5)。通过寿命拟合曲线最 终得到其平均寿命为3.22ns，单个寿命范围为407ps到114ns (图6)。

图5 量子点的荧光衰减曲线（红色）和拟合曲线（绿色）及拟合参数

图6 平均寿命及寿命范围 

TIP: DeltaPro 荧光光谱仪配置了新型高频脉冲半导体光源，作为荧光和磷光的激发光源，可以选择合适的长通滤光片减小杂散光的影响，实现25ps~1s范围的寿命测定。 

以上表征结果表明，我们可以利用吸收光谱，A-TEEM分子指纹图谱以及荧光寿命，来鉴定量子点溶液的吸光度、溶液的均匀性和污染物等的鉴别。

最 终，这些发光特性检测可以用来分析合成量子点的质量、新量子点组分上的差异，而且可以实时控制合成量子点的品质，从而帮助科研人员开发更高发光性能的量子点。

可以预见，未来开发具有高发光性能的量子点将成为可能，而且它必将作为一种新型荧光染料，推动生物医学成像技术的发展，从而为各种疾病的诊断、治 疗和实时监控提供新手段。同时，伴随着不断成熟的量子点技术，量子点产品也应运而生，我们相信，不久，量子点产品及技术也将进一步完成商品化，一个全新的量子点时代即将来临。