助力中国制“药”扬帆出海(二)，赛默飞高分辨质谱技术助力ADC药物的全面表征

魔法子 弹：ADC

上期提到的最近大热的魔法子 弹：抗体偶联药物（antibody-drug conjugate，ADC），概念提出其实已过百年。近年因技术取得突破，ADC药物重返创新药领域的热门赛道，业界认为其将会成为下一个“PD-1”！近年来，在FDA批准的抗体类新药中，ADC获批新药占比逐渐升高。一些品种还获得了FDA和NMPA的加速审批资格。因此，2019年被称为ADC之年。在中国，有很多非常优秀的药企已走在了ADC药物研发的前列，已有十多种品种授权“出海”，拿到数亿至数十亿美金的交易额。

那么，ADC药物研究的主要创新体现在哪些方面呢？从药物结构来看，包括抗体，连接子和药物毒素；另外，作为抗体的结合对象，抗原的选择也很关键，比如在癌细胞上高表达、正常细胞中低表达、降低脱靶效应、介导抗体的内化；另一方面，合适的偶连方式也将影响药物的活性；除此之外，在ADC的研发和制造过程中，对其质量属性的全面表征和监控至关重要。因此，检测与表征技术的不断完善也将帮助我们更好的确定药物的真实情况。

图  赛默飞ADC表征检测平台方案

赛默飞ADC表征分析方案：

DAR (药物抗体比) 指连接到每个抗体的小分子药物的平均数量，影响ADC药物的药效和稳定性，是ADC药物分析的关键质量属性。ADC检测项目除了单抗的工艺监控，分析表征和质控，小分子毒素，连接子的检测表征需求外，还有特有的DAR值测定和分布，连接位点的确认，小分子毒素是否与连接子断裂等分析需求。赛默飞领先的色谱质谱技术，帮助您更好的确定药物的真实情况，助力您在这个领域领先一步。

赛默飞Orbitrap高分辨

质谱技术助力ADC的全面表征：

我们在 Thermo Scientific™ Orbitrap Exploris™ 240 质谱仪上深入表征了ADC标准品，抗体半胱氨酸-荧光基团偶联物[1]。

图 1  Sigma ADC 模拟物结构示意图。

非变性条件下的DAR值分析

在 Thermo Scientific™ Vanquish™ UHPLC 系统上（溶剂为50mM醋酸铵，90 μL/min）使用 MAbPac™ SEC-1 色谱柱（5 μm，2.1 mmx 150 mm，P/N 088790）分离非变性完整样品。ADC 组成的多样性主要是由其核心抗体的生产过程以及药物偶联时产生的化学修饰所致（图 1）。半胱氨酸连接的 ADC 的主要构成形式的差异体现在 N-聚糖组成、连接的连接子-药物复合物的数量以及潜在的连接子连接数量上。

图2  非变性条件下，体积排阻色谱 (SEC) 与质谱联用用于分析 Sigma ADC 模拟物。(A) 基峰色谱图。(B) 在配有BioPharma Option 的Orbitrap Exploris 240 上，以 R=60,000的分辨率采集得到 Orbitrap 全扫一级质谱图。(C) 带有27+ 电荷态的放大视图。(D) ReSpect™ 解卷积结果，显示了 0-8 个 SMCC 连接子-药物复合物的分布情况。由软件根据所有已识别的糖型自动计算得到平均药物抗体比 (DAR)。

变性条件下的DAR值分析

图 3  变性条件下，Sigma ADC 模拟物的所有可能组成形式

在 Thermo Scientific™ Vanquish™ UHPLC 系统（A：0.1% 甲酸水溶液，B：0.1% 甲酸乙腈溶液）上使用MAbPac™ RP 色谱柱（4 μm，2.1 mmx 100 mm，P/N 088647）分离变性的完整样品。为了实现连接子-药物的偶连，通过还原打开半胱氨酸连接的 ADC 的链间二硫键。因此，在变性条件下，轻链和重链之间的非共价键会被破坏。在变性完整质量结果（图 4）中可以观察到多种 ADC 相关产物类型（图 3）。实验中获得了这些产物类型非常准确的完整质量（图 4，C-H）。

图4  Sigma ADC Mimic 在变性条件下的 RP LC-MS 完整质量分析结果。(A) LC 分离；(B) 在30k 分辨率采集得到的每个色谱峰的一级质谱及其放大谱图；(C-H) ReSpect解卷积结果。

ADC分子的肽图分析

在 Thermo Scientific™ Vanquish™ UHPLC 系统（A：0.1% 甲酸水溶液，B：0.1% 甲酸乙腈溶液）上使用Acclaim Vanquish C18 色谱柱（120Å；2.2 μm，2.1 x 150 mm，P/N 071399-V）用于肽图分析。使用 RP LC-MS/MS 对Sigma ADC 模拟物的酶解肽段混合物进行分析，得到的序列覆盖度>93%（图5）。

图 5. Sigma ADC 模拟物的肽图结果：基峰色谱图 (A) 和序列覆盖率 (B)。值得注意的是，胰蛋白酶酶切产生了一些小肽，由于这些肽太短而无法触发 MS2（红色虚线对应的插入框）。

表1 Sigma ADC模拟物的所有可能偶连位点

除了烷基化的SCDK肽段和铰链区仅含有2个linker的肽段未被找到外，我们在实验中成功鉴定到了表 1 中列出的大多数的肽段复合物。可能是由于这些位点被药物-连接子复合物高度占据，导致无法检测到这两种形式。图 6 显示了TVAPTECS 和 SCDK这两种肽段的色谱峰和 MS2 谱图。由药物产生的 MS2 诊断离子在谱图中被标出。

图 6. 肽段 TVAPTECS(A~D) 和 SCDK(E~H) 的药物-连接子及仅含有连接子的形式。A~B，药物-连接子 TVAPTECS肽段的色谱峰和 MS2谱图。C~D，仅含有连接子的 TVAPTECS肽段的色谱峰和 MS2谱图。E~F，药物-连接子 SCDK肽段的色谱峰和 MS2谱图。G~H，仅含有连接子的 SCDK肽段的色谱峰和 MS2谱图。

对于铰链区的肽段 THTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPK，除了烷基化形式（数据未显示）外，还鉴定到了四种不同的偶连形式（图 7）。由药物产生的 MS2 诊断离子和肽段的 b/y 离子在谱图中被标出。

图 7. 肽段 THTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPK 的不同偶连形式。A~B，1个药物-连接子+1个烷基化形式的MS2谱图及其局部放大图。C~D，2 个药物-连接子的 MS2谱图及其局部放大图。E~F，仅1 个连接子+1 个烷基化形式的MS1和 MS2 谱图。G~H, 1个药物-连接子 + 仅1个连接子的MS2谱图及其局部放大图。

结语：

抗体药物偶联物 (ADCs) 被认为是最有希望用于癌症治 疗的生物治 疗药物之一。在其开发和制造过程中，需要对其质量属性进行全面表征和监控。

· 我们在 Orbitrap Exploris 240 质谱仪上对半胱氨酸偶联 ADC 模拟物进行了非变性/变性条件下的完整质量分析和肽图分析。

· 成功测量了变性和非变性条件下该ADC模拟物的药物抗体比 (DAR) 和药物分布。平均DAR值由软件自动计算得到。

· 通过肽图实验对药物结合位点和结合位点占有率进行了全面表征。

参考文献：

[1] Zhang, X. et al. Comprehensive Characterization of Cysteine-conjugated Antibody Drug Conjugate (ADC) on a Hybrid Quadrupole-Orbitrap Mass Spectrometer. PO66110 EN0921S (2021)