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面临的挑战  

随着液相色谱技术应用越来越广泛，样品复杂性不断在增加。在分析检测领域，目前所面临的挑战是需要去分离更加复杂的化合物和强极性化合物，特别是结构类似的化合物，比如：下面的甾体药物，从结构式来看，7个化合物的母环是差不多（见下图），不同是的侧链的差别。

温馨提示：技术文章有点长，偷偷告诉您，看到文末有福利哦。

常用的C18&C8色谱柱无法实现结构类似化合物的分离。因为反相色谱柱是烷基固定相，其保留机理是主要是基于化合物的疏水强弱程度来进行分离。如果要分析的化合物之间碳链的长短有差异，即疏水程度有所差别，是能用C18&C8实现较好分离，但对于疏水程度没有太大差异，结构类似的化合物不能得到很好分离。

甾体药物，这7个化合物结构非常类似，主体差不多，其疏水程度差异不大。因此用C18色谱柱来分离，效果不是太好，化合物无法达到基线分离。

传统烷基固定相 (C18 & C8 )劣势:

结构相似化合分离策略？

我们继续以甾体药物的分离为例。那么基于这类烷基差异不大的化合物，我们可以采取什么分离策略呢？

分离度影响因素？

我们首先来看一下，色谱柱分离过程中，决定分离度的因素主要有三个，分别是保留因子（k)，选择因子（α），理论塔板数（N）。

其中选择性α是分离度最 大的贡献者，因此，要改善7种甾体药物的分离度，我们优先从色谱柱的选择性着手。

选择性影响因素

反相色谱中，色谱柱的选择性理论基础主要基于疏水消去模型（Hydrophobic substraction model, HSM）：即反相色谱柱的选择性（α）与疏水性（H）、位阻效应（S*）、质子供体（A）、质子受体（B）、硅醇基离子化（C）相关。

其中最主要的是前四个。第 一个疏水性，主要与碳链的长短有关，碳链越长，疏水性越强，与反相填料键合越紧密。第二个位阻效应，有点类似于分子筛，是根据分子尺寸来进行分离，分子大的就不能进入键合相的内部，而小分子化合物的就可以进入填料内部。第三个质子供体，类似于可以形成氢键的化合物，比如氟原子。第四个就是质子受体，比如酸性化合物，带羧基的化合物。 

结构相似化合物的解决方案 

基于影响选择性的疏水消去模型，为更好分离结构类似化合物，可以在疏水作用外在结合其他机理，使用特殊固定相，烷基固定相中键合芳香环及其他官能团。

由于苯环的特殊性质，有三个双键环状分子形成了共轭大π键，可形成空间效应、平面作用、偶极矩、范德华力等。因此苯环作为关键作用基团键合到烷基上后，可形成不同的选择性。

在烷基链上键合苯环，以3个C最常见，还有一些采用4个或者18个烷基上来键合。此外，还可以通过键合不同数量的苯环，形成不同选择性，比如可以键合一个苯环、二个苯环等，从而形成联苯基，二苯基，萘基、PFP等不同分离选择性色谱柱。

7种甾体药物的分离

——不同色谱柱对甾体化合物的分离对比

色谱条件：流动相  60%甲醇水溶液，流速  0.6 mL/min. 检测波长  254 nm.

使用常规C18色谱柱分离甾体药物，化合物1、2、3和5、6都无法实现基线分离

使用Epic苯基柱分离甾体药物，相比常规C18柱，分离度有了很大改善，1、5&6有了较好分离，但4、3&2分离不理想。此外，选择性发生了变化，化合物7的出峰顺序与C18不同。

使用Epic萘基色谱柱分离甾体药物，萘基是2个苯环，由于碳原子增加了，其保留也增强了，分离度进一步提升，但是化合物2、3仍未分开，同时化合物7和4的出峰的位置也发生了变化。

与萘基比较，联苯基的两个苯环不形成共面的分子，因此存在特异的空间位阻作用，最 终使得所有目标化合物达到较好基线分离，所有峰也很对称。相比C18色谱柱，选择性也发生了一些变化，化合物4 & 7出峰时间发生了变化。因此，最 终选择Epic联苯基作为甾体药物的分离理想色谱柱。（色谱柱信息：Epic Biphenyl ，250*4.6 mm,5 μm，货号：155291-EBPH） 

PerkinElmer苯基系列色谱柱 

PerkinElmer色谱柱（原ES色谱柱，2021年收购），可提供如下苯基色谱柱，满足您不同选择性需求。

Epic Phenyl苯基柱

在3个烷基上键合苯基基团，在总体保留能力方面与烷基固定相相似。苯基固定相表现出的替代选择性可通过苯环上的π-π 相互作用来解释。

应用：对于抗生素（如四环素）、中等碱（如麻醉剂）、一些酸性化合物（如喹啉抗生素和核苷）具有较好分离性能。

Epic Phenyl-Hexyl苯基己基柱

在6个烷基上键合苯基基团，与丙基（3碳）连接的苯基固定相化学相比，己基烷基链具有独特的选择性和更高的水解稳定性。这种保留固定相可以提供与 C6、C8 或 C18 等直链烃类固定相不同的选择性。

应用：对芳香族分析物、复杂样品和极性药物化具有较好分离性能。

Epic PFP LB低流失五氟苯基柱

五氟苯基（PFP）与苯基柱有些相似之处，都是苯环通过碳链键合于硅胶表面，只不过苯环上的剩余5个H是被氟原子取代了。

PFP将含氟基团引入键合相中，使溶质-固定相相互作用发生了显著变化，提供与 C18不同的选择性。苯环上的氟原子增强键合相和分析物之间的π-π相互作用，从而提高了对分析物的保留和选择性。使用含氟基团键合相，对取代位置不同的卤代混合物有较强的保留和极 佳的选择性，这将实现对卤化物位置异构体的保留和选择性。色谱柱同时也适合分析极性非卤化物，尤其适用于分析含羟基、羧基、硝基或其他极性基团的化合物。

应用：包括天然产物（紫杉醇系统）、卤代化合物、芳香化合物、共轭化合物和复杂基质中的痕量杂质。许多市场上所提供的PFP色谱柱因为流失严重，导致基线波动对痕量样品峰形影响严重，并不能满足痕量分析要求。

Epic PFP LB 色谱柱已经过稳定化处理，可提供低色谱柱流失、更长的使用寿命、更好的pH 稳定性和出色的LC-MS 性能。

Epic Diphenyl二苯柱

在烷基上键合了2个苯基，具有较低疏水性的Epic Diphenyl 键合相可以产生具有新选择性HPLC 色谱柱，可加快分离速度和提升分辨率，其利用强偶极-偶极氢键和 π-π 机制对含有双键或芳香官能团的化合物 提供不同选择性。此外，固定相的联苯基排列也有助于空间选择性，从而获得额外的色谱相互作用。

应用：对于包含芳香侧链的蛋白质也具有高度选择性。

Epic Biphenyl 联苯柱

由共价键连接至高纯度硅胶上的键合联苯基团固定相，其性质与是一种真正独特的ODS固定相明显不同，这可以对许多化合物产生了增强的保留能力，特别是那些含有可极化电子的化合物。

应用：对于含有可极化电子，包括卤化物、芳香族化合物、硝基芳香族化合物和共轭体系具有高度选择性。

Epic Naphthyl 萘基柱

由于萘基是刚性平面分子，且固定相具有较高键合密度，同时使用碱性灭活技术，从而使得许多非对映体分离所需的形状选择性成为可能。其表现出很强的 π-π 相互作用和电荷转移相互作用。

应用：对非对映体和非极性化合物有很好的分离效果。Epic Naphthyl 的独特性能使其在石墨化碳和烷基型固定相之间具有选择性。

苯基系列色谱柱买二送一

助力方法开发和结构类似化合物的分离，特推出PerkinElmer Epic苯基系列色谱柱买二送一活动。（注：以下表格仅部分 Epic苯基系列色谱柱，所有苯基系列色谱柱都可参加活动）

活动时间：即日起-2021年12月31日

鸣谢：最 后特别感谢PerkinElmer袁博士提供的技术素材内容，以及对技术文章提出的修改意见。