功能性肠道芯片的 4D 实时成像和计算模型评估蠕动如何促进肠道病原体入侵

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物理力对于生物功能而言不可或缺，但其在组织层面的影响尚未被完全理解。由于蠕动，肠道持续承受着机械应力。为评估机械线索对肠道病原体入侵的影响，我们将计算成像与具有机械活性的肠芯片相结合。在使用两种微生物中的任意一种对器件进行感染后，我们在绘制组织内机械应力的同时对其行为进行实时成像。这是通过重建正在进行的入侵的三维视频，并借助流形上的逆问题以及粘弹性流变学得以实现的。我们的研究结果表明，蠕动会加速溶组织内阿米巴对肠道组织的破坏和入侵，以及福氏志贺菌的定植。局部张力有助于寄生虫的穿透，并激活细菌中的毒力基因。总体而言，我们的工作突出了在宿主 - 病原体相互作用过程中物理线索的基础性作用，并引入了一个框架，为研究可变形组织的力学生物学开辟了道路。

环境刺激对细胞行为的根本重要性激发了人们对更具生理相关性实验的探索。细胞会整合源自多细胞相互作用以及外部生化和物理线索的信息。例如，人类病原体溶组织内阿米巴与上皮细胞紧密相互作用，并依据细胞外基质（ECM）的密度以及诸如促炎细胞因子之类的化学引诱剂来调控其迁移策略。另一方面，诸如剪切力这样的机械线索在诱导宿主分化的同时调节沙门氏菌中的基因表达。由流体流动产生的剪切应力也已被证实能够促进尿路中的细菌黏附。更广泛地讲，微尺度力探测器的发展近期助力阐明了物理相互作用对组织形态发生和细胞功能的影响，涵盖了诸如迁移、代谢调节和转录等多样化的任务。

为了在没有移植物、外植体或体内实验的复杂情况下来重现与所研究的病理学相关的外部刺激子集，近期的努力集中在体外构建新的微环境上。由此产生的细胞培养平台众多，范围从细胞能够自我组织的生物反应器悬浮液，到祖细胞嵌入其中进行分化并形成类器官的三维（3D）ECM 支架，以及最近利用微流控技术来模拟不同器官功能并引入机械应力的微制造芯片。

在这种情境下，器官芯片（OOCs）不仅能够促成不同细胞类型之间的相互作用，还具备多孔膜这一特性，能够维系不同的顶端和基底状况，进而促进组织内稳态、不透性以及功能极化。此外，OOCs 通常能够借助微流控设计重现营养物质的流动和机械蠕动。所有这些因素的结合造就了与诸多研究方向相关的动态类组织架构，尤其是宿主 - 病原体相互作用方面。例如，已有研究表明，由肠道芯片模拟的拓扑结构和蠕动周期对于重现临床研究中所报道的福氏志贺菌感染的毒性结果至关重要，而面对更简单的结肠细胞系的上皮单层，甚至是来自人类活检的肠类器官时，否则无法观察到这种情况。 

为对所研究的过程加以观察，器官芯片（OOCs）通常会在感兴趣的时间点予以固定，并切成薄片，之后便可成像。尽管它们在重现体内生理的部分关键特征方面成果显著，但器官芯片中动态现象的研究面临多重成像难题，在诸如肠芯片之类的可变形器官芯片中尤为如此。由变形引发的组织运动和曲率妨碍了恰当的二维共聚焦切片，而三维采集又跟不上移动的“器官”。另一个复杂情况源于某些器官芯片的架构：通常，多个通道与底部聚二甲基硅氧烷（PDMS）层的厚度共同作用，需要一个工作距离，这对于活细胞显微镜而言颇具挑战性。时至今日，这些障碍仅通过使用少数内部的光片显微镜得以部分化解，此类显微镜将芯片直接整合进其光学设计之中，例如通过光纤。正因如此，器官芯片几乎总是作为固定样本接受研究。器官芯片的另一重负担在于探测细胞力学的困难，因为芯片外壳致使组织难以触及。总之，所有这些技术问题阻碍了在这些与生理更相关的模型中对瞬时事件的实时研究，并使得针对当前研究兴趣的任何力学生物学研究停滞不前。

这在宿主 - 病原体相互作用中亦如此，此类相互作用几乎全然于固定的长期实验中予以研究。譬如，在肠道内，福氏志贺菌借由Ⅲ型分泌系统（T3SS）穿透上皮细胞进而进入肠屏障，该系统会注入诸多效应蛋白，最终促发自身的内化。一旦进入其中，此细菌离开液泡并操控其他机制进行复制且扩散至邻近细胞，最终于组织层面损毁肠道屏障。然而，在最初抵达宿主细胞之际，除却 T3SS 自身，福氏志贺菌缺失强效的黏附和运动装置。肠道芯片在阐明细菌如何从组织的拓扑结构中获益方面起着关键作用，规避了使用可能会使其在免疫系统中显著凸显的黏附素；它们还表明，蠕动对于提升感染的有效性至为关键。尽管如此，鉴于缺乏能够切实追踪病原体与组织进行物理化学相互作用时的时间演进的手段，尤其是在感染的早期阶段，这种有效感染过程背后的动态进程和机械相互作用仍未明了。

尽管肠道环境对其他致病性肠病原体的行为有已被证实的影响，但这些病原体在器官芯片中的研究仍有待开展。例如，溶组织内阿米巴原虫，即阿米巴病的病原体，也会侵袭肠道极化的上皮屏障，但其策略与志贺氏菌不同：该寄生虫依赖吞噬作用和细胞周围的蛋白水解作用。这两种机制都因与宿主细胞的化学相互作用而得到加强。组织的 3D 结构对寄生虫的运动能力也至关重要，同样突出了物理因素的重要性。通过将半乳糖/ N -乙酰半乳糖胺凝集素调节的瞬时黏附与基于肌球蛋白的泡状活动相结合，溶组织内阿米巴原虫以典型的阿米巴样方式迁移。正是由于它们的高运动性，阿米巴原虫尤其不适合固定研究。因此，机械蠕动在其致病性中的作用，以及它们与肠道的动态相互作用，几乎仍未被探索。

为了在生理相关的背景下研究动态的宿主-病原体相互作用，我们提出了一个框架，能够对诸如肠芯片等在周期性变形下的器官芯片（OOCs）进行 4D 实时成像。这种方法还允许探测组织的流变学，并实时估计组织内机械应力的时空分布。所得的成像框架实现了实时研究宿主-病原体相互作用所需的时间分辨率，并有效地绕过了芯片最初因封装而带来的物理不可接近性。通过这种方式，我们拓宽了器官芯片的应用范围，并为机械生物学研究打开了大门。我们在肠芯片上验证了我们的框架，肠芯片再现了蠕动下的肠道屏障，从而构成了探索物理线索在宿主-病原体相互作用中作用的一流平台。我们研究了与溶组织内阿米巴和福氏志贺菌相关的感染动态，发现这两种微生物都受益于蠕动，尽管方式不同。为此，我们表明，诸如细胞死亡或毒力基因更快激活等不同的入侵定量测量指标，分别与局部组织应力相关。这表明这两种人类病原体通过不同的方式利用机械力来适应结肠环境。例如，膜或连接张力诱导福氏志贺菌的毒力，加速细胞间的传播，而物理运动则提高了它们的定植速度。再例如，蠕动增强了溶组织内阿米巴的溶解活性所导致的组织破坏，同时帮助寄生虫更快地穿过张力较高的区域。总之，这些结果为感染早期阶段机械线索（特别是肠道蠕动）的作用带来了新的见解，并证明了我们的框架在使用器官芯片原位分析宿主-病原体相互作用动态方面的多功能性。

为了模拟肠道，我们使用了肠芯片（模拟；见材料与方法），其使用人类结肠细胞系 Caco2 或经 CRISPR-Cas9 编辑以表达 E-钙粘蛋白-绿色荧光蛋白（GFP）的衍生物进行成熟培养。我们对芯片施加幅度为 10％、频率为 0.15 赫兹（~T = 6.6 秒周期）的循环拉伸，以重现结肠的蠕动。这些值是根据临床研究选择的，并且与在肠芯片培养中发现的最生理的值一致（16、36、37）。在“可变形 OOC 的图像处理和力学生物学”部分，我们首先描述了一种对这些肠芯片系统进行实时成像的新方法，并接着引入了一个在此基础上进行力学生物学研究的框架。在“使用图像处理和力学生物学揭示病原体入侵的动态”部分，我们利用所得框架以定量方式研究肠道病原体的入侵。端到端工作流程的可视化总结见图 1。

                          图 1. 端到端工作流程示意图。
包含与其他图相关的完整工作流程的图表。在“可变形 OOC 的图像处理和力学生物学”中查找完整描述。WT，野生型。

研究活体可变形器官芯片（OOCs）的新方法组合可概括如下（图 1）：对感染了两种病原体中任意一种的芯片进行成像，从不同步的二维序列重建三维（含时间）的移动组织，将组织表面提取为一个流形，在遵循三维中的真实变形的同时将流形投影至二维以实现可视化，消除 z 轴的运动，因为其既不会引发任何机械变形，又会使可视化过程复杂化（图 2），测量组织内的剩余运动以计算其中的应力图（图 3），并将空间组织张力与局部感染度量进行比较（图 4 至 6）。感染度量是针对每种病原体定制的，并在材料与方法中有详细说明，例如细菌定植、毒力因子的激活以及寄生虫的渗透。

                            图 2. 可变形 OOC 的重建与可视化。
（A）图像采集。显微镜被编程为在每个 z 位置和每个通道拍摄时长为蠕动周期两倍的视频序列。放大图像显示了构成组织信号的 E-钙粘蛋白结构。图的右侧部分展示了两个在 z 方向上连续的序列的单个周期。所得到的序列带来了三个挑战。首先，它们不同步：两个 z 方向连续的序列之间存在时间滞后 sz+1（请注意底部序列滞后于顶部序列）。其次，组织并非平坦：即使在同一图像内，曲率也会使其中一部分失焦（请注意图像的一半是暗的）。第三，组织周期性地消失，随着拉伸而失焦（它“离开”图像，然后对于相同的 z 又回来）。
（B）图像处理。为解决这些问题，我们提出三个连续的处理步骤；我们用两个连续的图像：ti 和 ti+1 进行说明。（1）我们使用卡尔曼滤波器对所有周期性视频进行时间对齐。这针对所有 z 进行，从而实现了变形组织的 4D 重建。（2）为使弯曲的组织变平，拟合一个流形并投影到 2D（使组织处于聚焦状态）。（3）由组织移动引起的平面外运动通过拟合的正弦曲线进行校正。剩余的运动即为组织的拉伸（请注意它在两个图像中均保持可见）。

       图 3. 组织的流变学表征以及时空应力图的计算及其统计共定位。
(A) 从移动组织的重建到流形投影上应力的计算再到与其他测量的共定位分析的过程示意图。(B) 示意图：标准线性固体（SLS）模型通过弹簧和阻尼器的组合描述粘弹性材料的响应。右：一旦应力消除，应变向平衡的蠕变响应（纯弹性将是瞬时的）。衰减指数由延迟时间 τc 控制。(C) 从流形投影获得的组织位移图（箭头标记方向，蓝色低到红色高；比例尺，100 微米）在最大压力下显示了组织的不同部分拉伸方式的不同。病原体为紫色，组织为白色。(D) 从 (C) 获得的组织应力图显示了不同连接处张力的空间异质性。

                          图 4. 福氏志贺菌组织侵袭的定量动态。
(A) 在被持续表达红色荧光蛋白（RFP；红色）且在 T3SS 激活时表达绿色荧光蛋白（GFP；绿色）的福氏志贺菌（TSAR 菌株）定植 20 分钟或 2 小时后的体外类器官培养（OOCs）的实时旋转盘共聚焦图像，并对肌动蛋白进行实时标记（SiR - 肌动蛋白，白色）。比例尺，200 μm 和 20 μm（放大图）。(B) 对 (A) 中现象随时间的定量测量，WP - WOP 比较。顶部：生长菌落中的细菌数量。线条显示起始阶段的（最小二乘法）线性回归。n = 8 个芯片。中部：作为其分泌系统标志物的 TSAR 激活细菌数量的示例曲线。通过线性拟合区分出三个不同的侵袭阶段。n = 4 个芯片。底部：激活细菌与细菌总数的比例的示例曲线。插图：平台期 WP 和 WOP 比例之间的比率。n = 5 个芯片。(C) 福氏志贺菌在感染不同阶段与 OOCs 相互作用的固定图像：显示或不显示 T3SS 激活的细菌进入和细胞间传播（标签 1 至 3）。(D) 左：肌动蛋白与表达 GFP 和 RFP 的 TSAR 志贺菌以及 mxiD 菌株的统计共定位。右：将 (A) 和 (B) 中 WP - WOP 定植斜率的比率与非毒力 mxiD 菌株的比率进行比较。不等方差 t 检验。(E) 叠加 TSAR 激活时间的应力图（在一个周期内平均）；每个点对应于跟踪的激活的（x，y）坐标。(F) 直方图关系，显示 WP 中应力与 TSAR 激活时间的相关性与 WOP 代理的比较。

                     图 5. 溶组织内阿米巴侵袭组织的定量动态。
(A) 卵圆囊的实时旋转盘共聚焦图像。阿米巴原虫用红色细胞示踪剂标记（红色），死细胞用 Draq7 标记（黄色），肌动蛋白用 SiR-肌动蛋白标记（紫色），Caco2 细胞表达 E-钙粘蛋白（绿色）。(i 和 ii) 随着时间推移（30 分钟、2 小时），阿米巴原虫杀死上皮细胞并向深处渗透。朝着组织的顶部（距基底侧 80μm）和中部（40μm）。比例尺，200μm。插图：在上皮下渗透的滋养体，杀死周围的组织细胞。比例尺，20μm。(iii) 紧密连接随着时间被破坏；箭头指向被切断的连接部分。比例尺，20μm。
(B) 随时间对(A)中现象的定量测量，WP - WOP 比较。顶部：死细胞占总细胞的百分比。WP 的破坏迅速超过 WOP。插图：1 小时的特写。n = 8 个芯片。中部：阿米巴原虫渗透深度占组织总厚度的百分比。插图：WP 在不同时间（0μm，基底侧）寄生虫 z 位置在组织高度上的分布。n = 4。底部：组织连接性。n = 6。
(C) 侵袭的固定图像。左：1 小时。右：3 小时。顶部：阿米巴原虫溶解刷状缘肌动蛋白和 E-钙粘蛋白。底部：吞噬一个死亡的 Caco2 细胞（左）和组织内的死亡细胞（右）。比例尺，20μm。
(D) 组织连接性（左）和死细胞（右）（7 小时，活细胞）：对照组织、有阿米巴原虫的、WP 和 WOP 以及有半胱氨酸蛋白酶抑制剂（E64）的。不等方差 t 检验。*: 0.05；**: 0.01；***: 0.001；****: 0.0001。
(E) 半胱氨酸蛋白酶活性对于侵袭是必需的。感染 7 小时后作为共聚焦 z 层成像的切片的 3D 重建。有（右）和没有（左）E64 的阿米巴原虫，WP（顶部）和 WOP（底部）。

                     图 6. 溶组织内阿米巴组织侵袭的力学生物学。
(A) 随着时间的推移，感染溶组织内阿米巴的组织的延迟时间的实时 WP-WOP 比较。虚线对应于无组织的芯片。n = 6。(B) 应力图（在一个周期内取平均值），叠加了 6 小时时的穿透深度百分比；标记点的 x 轴无意义，因为为了提高准确性，穿透在 x 轴上取平均值。(C) 直方图关系，显示与 WOP 代理相比，WP 的应力与穿透百分比之间的相关性，其中 WOP 分布用于 WP 应力图。

组织重建与可视化
在 0.15 赫兹时，生理蠕动的频率相对于旋转盘共聚焦显微镜的采集速度（每堆栈约 8 至 32 秒）过高。再加上组织的厚度（约 200 至 300 微米），这阻碍了在可变形的器官芯片（OOCs）中进行实时 3D 成像。同样的运动也使 2D 成像变得复杂，因为它引入了一个正交分量，不断将组织推出焦平面（图 2A 以及视频 S1 和 S2）。第三个问题是组织的曲率，这导致了焦点在轴向（z）上的变化，实际上使视野减半（图 2A，“曲线”）。

Video1：共聚焦切片的肠芯片 10 倍。这是一个使用 10 倍物镜对用 Caco2 E-钙粘蛋白 - GFP 成熟的肠芯片进行共聚焦切片的影片。为简洁起见，该影片是在一个完整的蠕动周期内的实时情况。

Video2：共聚焦切片的肠芯片（20 倍）。这是一个使用 20 倍物镜对用 Caco2 E-钙粘蛋白-GFP 成熟的肠芯片进行共聚焦切片的影片。为简洁起见，该影片是在一个完整的蠕动周期内实时拍摄的。

为了研究宿主 - 病原体动力学，我们首先旨在以 4D 方式重建组织。为此，我们没有获取标准的 z 堆栈，而是对显微镜进行编程，在每个 z 位置获取一个连续的 14 秒（约 2T）的影片（图 2A）。利用所得的视频数据，我们通过开发三种特别的方法来应对上述挑战：对齐、流形投影和运动校正（图 2B 以及视频 S3 和 S4）。

Video3：4D 重建在流形 10x 上的投影。从Video 1 重建的 4D 序列在组织流形上的投影。

Video4：将 4D 重建投影到流形 20 倍。将从Video 2 重建的 4D 序列投影到组织流形上。

由于技术限制，可变形的器官芯片在活体中的研究鲜少开展。然而，我们在生理相关条件下对早期感染阶段的开创性观察证实，定量生物成像作为复杂高维数据集中的发现手段具有重要意义。为促进这一方向的发展，我们目前正致力于向器官芯片领域提供我们的计算开发成果。同样，本研究还旨在为流变学和力学生物学研究搭建一个平台。对生物功能中的物理线索的研究近来成为众多发现的关键：从器官层面 [例如在发育过程中，我们的方法能够揭示隐窝形成所涉及的机械相互作用] 到纳米层面[比如，微量移液管实验表明，在约 10 皮牛的拉力下，严重急性呼吸综合征冠状病毒刺突识别得以增强]。借助所提出的框架以及不同放大倍数的目标，此类研究如今能够在更贴合生理的条件下重复进行。在当前的工作中，这种方法使我们得以探究肠蠕动在肠道内宿主-病原体相互作用中的重要性。

对于福氏志贺菌（S. flexneri）而言，蠕动周期促进了其在结肠隐窝样结构中的定植。这在感染的第一个小时内尤为明显，并且可能有助于那些没有任何黏附素或迁移机制的细菌逃避免疫监视。我们的研究结果表明，蠕动至少在一定程度上由于局部组织应激增强了志贺菌的毒力。据报道，膜张力会重组质膜成分，如脂质和 F-肌动蛋白。关于志贺菌的入侵和细胞间传播，F-肌动蛋白和胆固醇是已知的关键宿主因子，它们会大量聚集到细菌病灶处。组织的周期性拉伸可能促进 F-肌动蛋白的局部紊乱，这要么更容易被志贺菌劫持，要么使细菌与质膜更紧密接触，从而触发毒力基因的表达，并可能解释传播率增加两倍的原因。

与福氏志贺菌沉淀到隐窝中不同，溶组织内阿米巴首先会与上皮细胞的顶端结合，因为它们与人细胞确实具有强大的黏附机制。为此，阿米巴表达了多种参与寄生虫 - 细胞相互作用的分子，如脂肽磷酰葡聚糖；富含赖氨酸和谷氨酸的蛋白；以及富含丝氨酸、苏氨酸和异亮氨酸的蛋白。蠕动增加了寄生虫渗透的速度和深度，但不利于顶端迁移。因此，由于顶端迁移程度更高，WOP 阿米巴在入侵开始时能够溶解更大一部分细胞，从而排除了循环运动只是增加感染传播的可能性。溶组织内阿米巴有可能感知调节其在上皮细胞上迁移和细胞杀伤活性的机械信号。局部张力和渗透之间的相关性表明，寄生虫可能优先结合处于张力下的膜，同时得益于更容易接近可能脆弱化的细胞连接来进行溶解。类似的机械信号传导之前在体外已有描述。

与体外人体外植体的情况非常相似，半胱氨酸活性对于肠芯片中的组织侵袭似乎至关重要。在蠕动作用下，寄生虫迅速使组织崩溃。周期性应力似乎有助于它们在张力增加时到达更深的位置，同时削弱连接处，从而以两种互补的方式增强裂解活性的作用，并表明蠕动对渗透阶段具有额外的机械影响。在这种情况下，寄生虫和宿主细胞的动态反应（例如通过转录调节或分泌因子）如何与机械应力相结合，以增加溶组织内阿米巴在蠕动作用下造成破坏的毒性，仍有待探索。 

众所周知，蠕动通过脱落上皮细胞和微生物群参与肠道组织的更新。胃肠道蠕动的抑制通常会导致细菌过度生长，这表明原则上，蠕动运动是限制感染风险的一个重要因素。然而，我们的研究表明，这种物理信号对于志贺氏菌和溶组织内阿米巴的入侵起决定性作用，这两种病原体在大小、生命周期和感染机制上有很大差异，但都偏好人类结肠而非肠道的其他部位。似乎这两种病原体已经进化到能够利用结肠的环境信号，尽管乍一看这似乎适得其反。因此，我们的工作促使我们重新思考应如何研究目标器官生态位中的宿主 - 病原体相互作用。

人类肠芯片
肠芯片是在由 Emulate（美国马萨诸塞州波士顿）提供的人类仿真系统中，由聚二甲基硅氧烷（PDMS）制成的空 S1 芯片（Emulate）培养而成。肠芯片的生产方案包括一个激活阶段，然后按照制造商的说明进行细胞外基质（ECM）涂层。简而言之，使用 ER-1 和 ER-2 溶液（Emulate）的混合物激活芯片，并在紫外线（36 W，365 nm）下照射 20 分钟。然后，先用 ER-2 溶液冲洗芯片，然后用 PBS（Gibco）冲洗。接下来，在细胞接种前，将 ECM 溶液[在 PBS（Gibco）中稀释的基质胶（100 μg/ml；Corning）和 1 型鼠尾胶原（30 μg/ml；Gibco）]在 4°C 下孵育过夜，在 37°C 和 5% CO2 下孵育 1 小时进行涂层。细胞以 150 万个/ml 的浓度在上通道中接种 2 小时，条件为 37°C 和 5% CO2。细胞附着后，用上部通道用添加了青霉素（100 U/ml）和链霉素（100 μg/ml）的温热细胞培养基轻轻冲洗。然后，细胞在 S1 芯片上无灌注培养过夜。最后，将芯片连接到 Pod-1（Emulate）并放置在 Zo? CM1（Emulate）中；在培养期间一直放在那里。采用以下培养条件：37°C、5% CO2、流速为 30 μl/小时、横向机械拉伸 10%，频率为 0.15 赫兹。每 48 小时更换一次培养基。

肠芯片感染
根据病原体的不同，在感染前立即将芯片与以下适用的探针子集一起孵育：
1）对于溶组织内阿米巴。在感染前，芯片的两个通道都充满了含 DRAQ7（一种仅对死亡或透化细胞的双链 DNA 染色的远红染料；1/50，最终 6 mM；Abcam）的温热 iTY（37°C），偶尔还含有 E64（半胱氨酸蛋白酶抑制剂；100 mM；Alfa Aesar）。作为初步措施，随后立即在 37°C 下在显微镜下检查芯片 10 分钟。准备好感染后，将芯片暂时从显微镜中取出，其顶部通道充满含 106 个滋养体/毫升以及 DRAQ7（偶尔还有 E64）的温热 iTYI 溶液。然后将芯片放回显微镜（37°C）下并连接到微流控泵。

2）对于福氏志贺菌。在感染前，芯片的两个通道都充满了温热的培养基，其中含有一种或多种 Pro12A（蓝色膜染料；2 nM）、SiR-肌动蛋白试剂盒（0.2 nmol；Spirochrome）和凝集素（花生凝集素）AF647（1/500；储备液：3 摩尔染料/摩尔；远红染料）。
Pro12A 是一种非商业性的膜标记物，与商业染料相比，它能更好地特异性标记上皮细胞的膜为蓝色，并且通道泄漏更少。它由 A. S. Klymchenko 实验室提供。

活细胞显微镜观察和压力控制
在感染过程中，使用尼康公司的 T2i 转盘式共聚焦显微镜和滨松 ORCA-Flash 4.0 数字互补金属氧化物半导体（CMOS）相机对肠芯片进行成像，不过偶尔也会使用 Photometrics Prime 95B sCMOS 相机。根据目的不同，物镜要么是 10×[Plan Apochromat 10×DIC N1，数值孔径（NA）为 0.45]，要么是 20×（Plan Apochromat Lambda 20×，数值孔径为 0.75）；更高放大倍数的物镜工作距离不足，无法通过芯片的底部通道进行成像。显微镜通过尼康专有的 NIS Elements 软件的 JOBS 环境进行编程（见 NIS-Elements_JOBS_and_HCA）。我们选择共聚焦显微镜是因为其易用性：晶格光片显微镜具有更好的穿透性和速度（尽管对于 3D 成像仍不够快），但与芯片尺寸不兼容，除非专门为此进行修改。

芯片真空通道中的压力由 Fluigent 微流控压力控制器（Flow EZ，LineUp 系列）控制。为了模拟蠕动，向芯片真空室输入正弦压力，周期为 6.6 秒，振幅为-350 毫巴（在 0 至-700 毫巴之间振荡），导致最大组织拉伸约 10％。在进行流变学实验时使用了其他压力设置。使用 Fluigent 的 Microfluid Automation Tool 软件对泵进行编程。有时，使用与真空泵相连的 Elveflow 微流控控制器（OB1 MK3+）也能达到相同的效果。在实时成像期间，肠芯片上下通道的培养基灌注均停止。


参考文献：
Boquet-Pujadas A, Feaugas T, Petracchini A, Grassart A, Mary H, Manich M, Gobaa S, Olivo-Marin JC, Sauvonnet N, Labruyère E.
4D live imaging and computational modeling of a functional gut-on-a-chip evaluate how peristalsis facilitates enteric pathogen invasion.
Science Advances. 2022, 8 (42): eabo5767. doi: 10.1126/sciadv.abo5767.

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