担心PCR扩增的影响？来看自动化PCR-Free解决方案

常规高通量测序的文库构建，需要PCR扩增。主要是为了对微量DNA样本进行扩增，提高库容；另一方面，放大核酸荧光信号，提高测序准确度。然而，PCR扩增同样也有着无法忽视一些问题：

1.      扩增过程中产生复制错误，累积下去，产生假阳性；

2.      扩增会有一定的偏好性，比如GC含量异常的区域和二级结构等区域，扩增效率低，难以覆盖；

3.      扩增的循环数越多，重复率（Duplication）越高，造成测序成本增加、浪费测序数据。

什么是PCR-Free技术

常规扩增建库有诸多问题，那么PCR-Free技术也就营运而生。PCR-Free技术，相较于常规建库，其建库步骤为：基因组片段化-末端修复-加接头-纯化-文库质控，省去了PCR扩增的步骤。

1.      PCR-Free建库技术：

2.      省去扩增步骤，缩短建库时间；

3.      避免使用高保真聚合酶，降低建库成本；

4.      减少扩增产生的复制错误；

5.      避免扩增偏好性；

6.      避免扩增产生的Duplication，降低测序成本。

llumina DNA PCR-Free Prep，Tagmentation DNA建库即运用了PCR-free的建库方式，并同时采用创新型链接在磁珠上的转座酶（BLT），将接头连接和DNA 片段化结合到一个简单快速的反应中，实现WGS高度均匀的覆盖。

针对PCR-Free建库方法，我们推出了基于Biomek i7工作站的Illumina DNA PCR free文库构建自动化方案，该方案可使用低投入量（25-99ng）或标准投入量（100-2000ng）gDNA进行建库，同时进行96例样本的建库。

·        减少手动操作时间

·        减少系统设置何潜在的移液错误

·        标准化工作流程改进实验结果

·        快速安装

Biomek i7工作站

图1. Biomek i7 Hybrid Genomics Workstation工作桌面

·        集成了96通道移液头与灵活8通道移液头；

·        灵活8通道可配置固定针和可替换吸头通道搭配；

·        96通道可选择上一列、一行、多行等不规则形状排列吸头，实现不定样本数液体转移；

·        斜侧抓板机械手可360度旋转，轻松实现台面全覆盖；

·        多达45个工作板位；

·        可实现震荡、加热/冷却、吸头清洗等功能；

·        开放式工作桌面，可轻松整合外部设备，如（自动PCR仪）。

图2. Illumina PCR free DNA Library Prep 自动化工作流

使用Biomek i7工作站进行 Illumina PCR free文库构建，轻松解放双手，把更多的活交给工作站来进行

表1.  Biomek i7 Hybrid Genomics Workstation自动化Illumina PCR free流程预估时间（大于100ng gDNA投入）

Method Options Selector (MOS）

MOS能够选择样本数量、投入量、Index开始使用位置，以最大限度地提高灵活性、适应性和方法执行的简易性。

图3. Illumina PCR-Free建库方法选项选择器

Guided Labware Setup (GLS)

GLS基于MOS中选择的选项生成的，并提供用户特定的图形设置说明，包括试剂体积计算和准备试剂的分步说明。

图4. 引导式实验室设置提供配方注释，指示试剂量（上图），

并指导用户正确设置平台（下图）

DeckOptixFinal Check (DFC)

在开始运行自动化流程之前，BML中的DFC功能，会通过实时拍照的方式分析工作桌面耗材摆放，以减少设置错误，例如吸头、深孔板摆放位置错误。

实验设计

为了证明在i7双杂交工作站上进行96个样品文库制备的能力，我们从人细胞系NA12878 gDNA制备文库。将起始浓度为150 ng、300 ng、400 ng、500 ng和750 ng的48个gDNA样本以及阴性模板对照（NTC）随机放入96孔板，如下所示。

实验结果

·        随机挑取了23个 gDNA文库进行测序，平均插入片段为483bp±28bp

·        Reads mapping率为96.8%，标准偏差为0.1%

Biomek i7工作站上的Illumina  PCR free DNA文库制备自动化是一个完全独立的解决方案，为任何规模的实验室提供了高效、灵活和可扩展的解决方案。自动化解决方案提供的文库在下游工作流程中产生高质量的结果，并节省了宝贵的时间和金钱。