UHPLC-MS方案｜下游生产工艺中HCP定性/定量分析

前言

宿主细胞蛋白 (Host Cell Protein, HCP) 是细胞生长和后续生产工艺中来源于宿主细胞系的生物药品杂质，会对药品ZZ的安全性和有效性产生不利影响。因此，必须通过一系列纯化步骤去除这些 HCP。国际人用药品注册技术协调会(ICH)、美国食品和药物管理局 (U.S. FDA)、欧洲药品管理局 (EMA) 和其他国家的监管机构都有关于 HCP 监测的指南。

在本文的研究中，我们对三个来自于下游生产工艺不同纯化阶段的样品进行了基于LC-MS高分辨质谱串联平台的定性及定量分析，并对每个样品中存在的高风险HCP进行了特别标注。分析流程请见图1。

图1 实验整体流程

在经过一步ProteinA纯化后的样品中，鉴定到676个具有定量信息的HCP（peptide≥3,下同）；再经过一步阴离子交换色谱（AEX）纯化后，HCP数目下降至111；在此基础上再进行一步阳离子交换色谱（CEX）纯化后，仅检测到7个HCP。三个样品中定性及定量的HCP数目请见表1。

表1 不同纯化阶段样品中定性并定量的HCP，所有数据均为三次生物重复的平均值

对于会引起免疫响应、降解蛋白或辅料的高风险HCP是科学家们在产品工艺的优化过程中尤为注意的。图2展示了随着纯化步骤的增多，高风险HCP数目呈减少趋势。图3展示了经过三步纯化后依然能够鉴定到的三个高风险HCP及其各自的含量。

图2. 不同样品中高风险HCP数目变化趋势

图3. 经过三步纯化后样品中依然能鉴定到的高风险HCP

本实验中所有数据均是由一站式生物制药分析软件BioPharma Finder4.1处理。该软件内置HCP分析功能，可同时对目标蛋白和HCP进行搜库、定性和定量（图4~6）。

图4 HCP鉴定结果展示界面

图5 同一个HCP在不同样品中的变化趋势，每个样品均进行了三针技术重复

图6 三步纯化后一条来源于高风险HCP肽段的二级谱图及覆盖率

客户得益

●用非变性酶解条件进行 HCP 鉴定和相对定量的工作流程，然后进行 LC-MS/MS 分析。

●使用 UHPLC 系统和高分辨率精确质量 (HRAM) 质谱仪在宽动态范围内进行HCP定性与相对定量，灵敏度可低至约 1ppm。

●为各个 HCP 提供定性和定量信息，可用于指导下游工艺开发和优化决策。

●证明 POROS 树脂具有高选择性，可有效去除不同含量和种类的 HCP。

●Biopharma Finder 4.1单一软件解决方案，可同时提供目标蛋白的肽图分析结果及HCP的定性定量结果。

本研究中使用的样品由赛默飞生物工艺部下属的生物工艺设计ZX（Bioprocess Design Center, BDC）所提供。该ZX总监马骏表示，近年来，有关抗体药品中的HCP可能导致临床不良反应的报道屡见不鲜，其中某些高风险HCP被发现可能是导致不良反应的主要因素。这些案例从客观上对我们提出了一个新要求：在抗体药物的CMC开发过程中，越早对HCP进行更进一步的分析鉴别，越快在工艺开发中去除高风险HCP，就越有利于该药品在临床阶段的成功，而LC-MS联用的方法无疑为这一需求提供了可靠的工具。

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