轻松解锁新方法：纳米级分选

纳米级流式细胞术作为一种可表征亚微米级颗粒的先进技术通常应用于细菌、病毒、细胞外囊泡（EV）和外泌体等生物微粒的检测。得益于流式分选技术高通量和多参数等优势功能，此方法学受科研工作者青睐。

CytoFLEX流式细胞仪具备卓 越的检测性能和灵敏度。经验证，贝克曼库尔特CytoFLEX平台分析仪能够使用紫光侧向角散射光参数实现分辨80nm聚苯乙烯纳米颗粒。随着光学技术革新和流式细胞术在EV分析应用领域的日益普及，纳米级流式细胞术的标准化渐趋成熟。这种具备严谨性和易用性且实现高通量、单颗粒表征的强大分选能力，不仅推动了细胞免疫学的持续发展，同时也使其得以在EV研究领域大展身手的优势所在。

单细菌分选（>250 nm）

使用FITC（525/40）通道分析黄色荧光蛋白标记的活化枯草芽孢杆菌样品。圈选阳性细菌，将单细菌分选至载玻片上并通过荧光显微镜进行观察验证。本实验旨在验证仪器对折射率类似于EV（1.38）的微小生物（长度2~6 μm，直径0.25~1.0 μm）进行分选的能力。

枯草芽孢杆菌分选实验。使用分选区域对培养的细菌进行分选，去除细胞碎片和双粘体，最 终获得黄色荧光蛋白阳性细菌（VSSC阈值1650/增益300、FITC-750、SSC-100）。随后将其沉积至载玻片上，并使用奥林巴斯BX62显微镜进行观察。在使用浸镜油的40倍物镜下使用Andor Sona相机拍摄图像。

纳米荧光微球分选(100nm )

将100nm 黄绿荧光聚苯乙烯微球与150nm非荧光微球混合。对100nm微球进行分选，五粒微球沉积至一块载玻片，另外单一微球沉积至另一块载玻片。采用较低阈值设置（VSSC 阈值3000/增益300，FITC-400，SSC-500），观察两组微球群体，并排除背景。

100 nm 黄绿荧光微球分选。利用VSSC参数上的100nm区域分离100nm微球（上图）。将微球沉积至载玻片上，成像质控。对每点5粒（左）和每点1粒（右）微球进行分选。每幅图像上的箭头表示100nm微球的位置。注意：鞘液蒸发形成盐晶导致背景水平较高。

eGFP和tdTomato标记的病毒样颗粒（VLP）分选(100-120nm，RI 1.369 )

在VSSC触发条件下分析样品，然后分别切换至两种荧光蛋白信号作为对应的荧光触发条件。按照FCMPASS方案所述，使用NIST微球设置VSSC阈值。至少收集100,000个事件。然后使用Amicon过滤器对收集管液体进行浓缩，并在仪器上进行重新分析。结果如图所示。

GFP+和GFP-病毒样颗粒分选。阳性收集管（右下图）显示先前确定的阳性门（中上图）中96%以上的事件。阴性收集管（左下图）显示阳性门中1%以下的事件。

将具有eGFP和tdTomato 荧光标记的VLP样品混合，以测试SRT分选仪能否有效分离高纯度的不同荧光标记细胞群。将样品分选至FITC阳性门和PE阳性门后，对收集管进行纯度检测。tdTomato阳性细胞群纯度为97%，GFP阳性细胞群纯度为98%。结果如图所示。

tdTomato和GFP 荧光标记的VLP分选。（A）增益和阈值：VSSC 200、SSC 400、GFP 700、tdTomato 500。阈值VSSC 4000。（B）增益和阈值：VSSC 200、SSC 400、GFP 700、tdTomato 500。阈值GFPH 1000、tdTomato 1000。（C）基于B图分选细胞群的回收率。通过单纯运行样品缓冲液以调整阈值去除大部分噪声，确保减小仪器噪声水平。

目前，多项技术可用于纳米级生物制剂的分析和表征。由于流式细胞术在纳米级研究领域的广泛应用，以及分离特定颗粒需求的日益迫切，我们对 EV分选的可能性进行了测试。CytoFLEX SRT细胞分选仪能够分选直径远小于1微米的颗粒。针对细菌、病毒样颗粒和微球的分选实验均获得了高质量结果。实验证明，CytoFLEX SRT可以在复杂性远低于其他已发表的流式细胞术解决方案的仪器中分选出高纯度纳米级颗粒。

贝克曼库尔特生命科学公司感谢细胞外囊泡检测中心流式细胞技术总监、项目总监John Tigges和贝斯以色列女执事医疗中心Brandy Pinckney在实验过程中提供的专业知识和支持，感谢波士顿大学国家新兴传染病实验室Rahm Gummuluru博士提供的荧光标记的VLP样品。