湿热灭菌验证生物指示剂的选择

作为目前最有效的灭菌方式之一，湿热灭菌被广泛应用于制药及医疗等行业。湿热灭菌过程中存在不同温度、时间的灭菌程序设定，针对不同的灭菌条件，如何选择合适的生物指示剂需要经过仔细考量。

那么针对不同灭菌程序验证如何选择合适的生物指示剂呢？今天，我们就为大家分享生物指示剂选择的几个关键点。

F0值的概念

湿热灭菌验证中经常会遇到“F0”这一概念。什么是F0？它是蒸汽灭菌程序赋予一个容器或产品121℃下的标准灭菌时间。不管在什么场合，只要提到F0值，温度都指121℃。

当提到F0时，它对应两种概念：

（1）代表灭菌程序的物理杀灭时间，用FPhy表示，通常由灭菌器计算得出；

（2）代表生物指示剂的生物杀灭时间，用FBio表示，通过生物指示剂的D值和芽孢数量计算得出。其计算方法为：

FBio=D121℃ X LR

式中：D121℃=生物指示剂在121℃的D值

         LR=灭菌程序使生物指示剂芽孢数量下降的对数单位

FPhy和FBio的关系

在湿热灭菌验证过程中，只有FPhy和FBio表现出一致性，才能证明灭菌程序的有效性。理论上，在同一个位置测得的物理杀灭时间和生物杀灭时间应该是相等的。灭菌验证要求生物指示剂试验结果呈全阴性，这就要求物理杀灭时间比较大，即FPhy>FBio。

例如，某一灭菌程序获得的物理杀灭时间FPhy为12分钟，选择生物指示剂的FBio为12分钟，该灭菌程序将指示剂杀灭到100，指示剂大概率呈阳性，导致灭菌失败。因此，要保证指示剂经杀灭后呈全阴性结果，要求物理杀灭时间FPhy大于生物杀灭时间FBio。

湿热灭菌验证生物指示剂的选择

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过度杀灭法

美国注射剂协会（Parenteral Drug Association，PDA）第1号技术报告《湿热灭菌程序的验证：灭菌程序的设计、开发、确认以及日常控制》指出过度杀灭法FPhy和FBio均大于或等于12分钟。某生物指示剂的参数见表1。假设灭菌条件为121℃，12分钟。其物理杀灭时间FPhy为13分钟～15分钟。现采用案例中生物指示剂进行灭菌验证，灭菌程序获得的物理杀灭时间FPhy（13分钟～15分钟）略大于生物指示剂的FBio（12分钟），但小于生物指示剂的杀灭时间（20分钟），故灭菌结束后指示剂有概率呈阳性。因此，在选择生物指示剂时，可参考《欧洲药典》的建议，以物理杀灭时间FPhy将指示剂杀灭到10-1～10-3为宜，即灭菌工艺为121℃，14分钟～18分钟。

表1 某生物指示剂参数信息

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残存概率法

由于部分产品无法耐受高温灭菌，为达到无菌保证水平（Sterility Assurance Level，SAL）≤10-6，可选择输入热量较低的残存概率法灭菌，即8≤F0<12的灭菌程序。这类灭菌程序要求用户对灭菌产品进行日常监控，确保污染微生物的耐热性低于生物指示剂。部分用户对这类灭菌工艺的验证中生物指示剂的选择存在误区。残存概率法按照灭菌温度可分为两类，文章对这两类灭菌程序的生物指示剂选择进行介绍。

残存概率法灭菌分类

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灭菌温度为121℃

该类灭菌程序通常为121℃灭菌8分钟～10分钟。建议选择嗜热脂肪地芽孢杆菌作为指示微生物。市售的生物指示剂芽孢数量为106以上，一般FBio≥12分钟，均不适用。《欧洲药典》指出，这类灭菌工艺的验证可选择芽孢数量103或104的生物指示剂。

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灭菌温度为110℃~118℃

国家药品监督管理局2020年发布的《化学药品注射剂灭菌和无菌工艺研究及验证指导原则》指出，残存概率法灭菌工艺的验证可以选择D121℃低于1分钟的生物指示剂。以芽孢量为106为例，当D121℃为1分钟时， FBio为6分钟。对于这类灭菌温度较低（110℃～118℃）的灭菌程序的验证，可以选择枯草芽孢杆菌ATCC 35021作为指示微生物。由于菌种本身特性决定，该菌株D121℃在0.3分钟～0.5分钟之间，因此该类指示剂的FBio<8。是否生物指示剂的FBio<8就无法证明灭菌产品的无菌性？答案是否定的。

大量研究表明，常规污染微生物的耐热性D121℃为0.1分钟。根据PDA1号技术报告提供的计算方法，将其从106杀灭至10-6需要1.2分钟，即物理杀灭时间FPhy为1.2分钟。当灭菌程序的FPhy为8分钟，污染微生物存活率为10-74，满足SAL≤10-6的要求。要强调的是，当使用残存概率法进行灭菌时，应对产品进行监控，确保污染微生物的耐热性低于生物指示剂，才能保证被灭菌产品的无菌性。

图1 常规微生物与不同生物指示剂的耐热性比较

特别说明

F0作为评价灭菌程序灭菌能力的标尺，对产品的无菌保证水平具有重要意义。企业应根据产品和灭菌工艺的特性，选择合适的生物指示剂并开展相关验证。

参考文献

[1] The United States Pharmacopieial Convention. USP43-NF38[S]. 2020:8218.

[2] Council of Europe. European Pharmacopeia 10.0[S]. 2019:622-624.

[3] 国家药品监督管理局. 化学药品注射剂灭菌和无菌工艺研究及验证指导原则(试行)[S]. 2020.

[4] Agalloco J P, Akers J E, Allinson W, et al. Validation of moist heat sterilization processes: cycle design, development, qualification and ongoing control[J]. PDA journal of pharmaceutical science and technology, 2007, 61:2-51.