文献分享 | HPLC-CAD法用于新冠mRNA疫苗中脂质体含量测定

今天与大家分享一篇由中国食品药品检定研究院（NIFDC）与赛默飞世尔科技（中国）有限公司共同发表于Vaccines的文章，主要内容为基于电雾式检测器（CAD）完成了对于新型冠状病毒mRNA疫苗中脂质体方法学的建立及验证，并完成了mRNA疫苗中脂质体含量的测定，对于控制mRNA疫苗的安全性和有效性具有重要意义。

01、背景介绍

2023年6月15日，比尔∙盖茨在全 球健康药物研发中心举办的特别活动中表示， mRNA疫苗技术使预防结核病和疟疾等疾病的疫苗成为可能。与传统灭活或减毒病毒疫苗、基因工程重组疫苗和基于病毒载体的疫苗等疫苗平台相比，mRNA疫苗具有安全性高、表达瞬间、体液免疫和细胞免疫双重机制、生产工艺简单、生产效率高、成本低等特点。因此，它们在处理大规模和新出现的流行病方面具有突出的优势。然而，mRNA疫苗也存在不稳定、免疫原性高、递送效率低等缺点。定制递送系统的开发可以进一步提高mRNA疫苗的稳定性和转染能力。脂质纳米颗粒是目前这些mRNA疫苗应用最广泛的递送系统。

一种用于COVID-19 mRNA疫苗递送的LNPs系统(如下图1所示)，使用以下四种类型的脂质体：具有胺官能团的阳离子脂质 (9001)，脂质-聚乙二醇2K偶联物(DMG-PEG2K)，胆固醇(CHOLE)和两性离子辅助磷脂(DSPC)。脂质体在储存和运输过程中容易聚集和降解，影响了COVID-19 mRNA疫苗的效率和安全性。因此，脂质体的含量对确保COVID-19 mRNA疫苗的质量至关重要，需要在生产和放行阶段严格控制。本文建立了一种高效的高效液相色谱-电雾式检测器(HPLC-CAD)方法，用于LNPs包封的COVID-19 mRNA疫苗的脂质体分析，并对该方法进行了全面的方法学验证。

图1. LNP递送系统

02、材料及方法

仪器配置：

Thermo Scientific™ UltiMate™ 3000 液相色谱仪、Thermo Scientific™ Corona™ Veo™ RS CAD检测器

色谱条件：

C18色谱柱；流动相A：0.01M 乙酸三乙胺水溶液，流动相B：0.01M 乙酸三乙胺甲醇；流速为1.0 mL/min；柱温为55℃；进样体积：10μL

梯度洗脱条件见下表：

电雾式检测器：采集频率10Hz；蒸发温度50℃，滤波3.6s

03、结果与讨论

专属性实验结果

对比混标溶液、专属性溶液（不含脂质体的mRNA的空白）和纯甲醇色谱图结果可见，脂质体出峰位置没有其他干扰峰的存在。

图2. 50%浓度混标溶液(a)、专属性溶液(b)和纯甲醇(c)色谱图

准确性实验结果

分别对PEG2K-DMG、CHOLE、DSPC和9001进行混合添加回收率测定，添加浓度分别为50%、75%、100%、125%、150%、200%，各3个平行，两个验证实验室共重复6天。结果表明，所有添加样品中的四个脂质体的回收率均在90%~110%之间。表明该方法准确性良好。

图3. 两个验证实验室不同添加浓度(50%, 75%, 100%, 125%, 150%, 200%)回收率（点击查看大图）

线性实验结果

分别配制PEG2K-DMG、CHOLE、DSPC和9001的浓度为50%、75%、100%、125%、150%、200%的标准溶液，测定得到二次线性曲线，所有标准曲线的相关系数均大于0.99。

表1. 脂质体标准曲线

样品测定结果

使用上述方法，使用流动相B对COVID-19 mRNA 疫苗样品稀释20倍后直接测定，样品中脂质体测定值与理论值接近，结果见下图所示。

图 4. 样品及空白溶液色谱图结果

04、结论

本文建立了CAD检测器测定mRNA疫苗中脂质体含量的方法，并完成了整套的方法学验证及对实际疫苗样品的测定，结果均表明此方法是可靠的、准确的、无干扰的，适用于mRNA类疫苗中脂质体的安全性和有效性质控。

从CAD检测器进入2020版中国药典的数多年，到今年4月30日美国药典USP发布的“Analytical Procedures for mRNA Vaccine Quality”2.0草案中明确写明脂质表征和含量测定使用CAD检测器。CAD检测器得到了越来越多国内及国外客户的认可及使用，协助客户完成产品的研发至质控工作。

参考文献：

[1] Validation of an HPLC-CAD Method for Determination of Lipid Content in LNP-Encapsulated COVID-19 mRNA Vaccines. Vaccines. 2023,11, 937. https://doi.org/10.3390 /vaccines11050937.