如何正确选择色谱柱，使得实验室操作事半功倍！

分割模式

液相色谱柱有多种类型。 在准确选择液相色谱柱之前，首先要选择HPLC分离模式。 根据所使用的固定相和流动相的组合，可以获得以下各种分离模式。

了解样品

了解待测样品的结构、分子量、溶解度、电离度、极性、pH值等理化性质，然后参考下图选择合适的分离方式和准确的液相色谱柱固定相：

色谱柱参数

影响色谱柱性能的因素有很多，例如硅胶纯度、色谱柱尺寸、颗粒形状、粒径、表面积、孔径以及包括键合类型、碳覆盖度和封端在内的化学性质。 下面介绍各参数对色谱柱性能的影响。 根据以上参数准确选择液相色谱柱。

1、硅胶纯度

硅胶的纯度对于高极性化合物的分离最为重要。 硅胶中残留的金属离子浓度和杂质会影响化合物的峰形。 硅胶表面金属含量高，会影响碱性化合物的峰形，容易出现拖尾。

2. 色谱柱尺寸

增加色谱柱的长度可以在一定程度上提高柱效，但也会增加压力，导致峰变宽； 含量测定、溶出度检测等对分离要求较低，可采用较短的色谱柱，以减少运行时间。 大内径增加了样品装载能力，但也增加了横向扩散，这也导致峰变宽。 内径较小的色谱柱灵敏度较高，峰形较窄，但上样量较小。 如果进样量满足要求，并且需要更高更尖的峰来提高灵敏度，可以选择更小的内径，但压力会更大，对系统要求更高。

短柱（15-100mm）运行时间短，柱压低；

长柱（150-250mm）分辨率高，运行时间长；

小内径（≤2.1mm）探测器灵敏度高；

内径大（3-21.2mm），载样量高，耐污染，寿命长。

3. 颗粒形状

粒径 球形颗粒，柱效高，重现性好，柱床结构均匀。 不规则形状的柱床结构结构不均匀，流动相线速度不均匀，容易出现谱带展宽； 当使用较高粘度的流动相时，球形颗粒可以降低柱压，延长柱寿命。

两种常见类型的填料颗粒：

全多孔硅胶型

表面多孔/核壳型

相同键合基团的键合技术具有相同的选择性； 全多孔填料更常见，并且具有更多类型的粘合相； 核壳填料可以在较大粒径下实现更高的柱效，从而降低使用压力。

4. 粒径

粒径是指装柱颗粒的直径。 事实上，色谱柱上标注的粒径是平均值，通常为1.5-10μm。 粒径较小的色谱柱具有较好的分离度，但柱压较大。 如果5μm粒径色谱柱的分辨率稍显不足，则同型号的3μm色谱柱的分辨率通常可以提供令人满意的选择性。

5.表面积

表面积是指颗粒的外表面和内部孔隙面积之和，以m2/g表示。 高比表面积，具有较强的保留能力、柱容量和分离能力，适用于多组分样品的分离； 低表面积的柱填充可以快速达到平衡。 状态，这对于梯度洗脱尤为重要。

6. 光圈

孔径是指填料颗粒的孔或空腔的平均尺寸，范围为120～300°。 多孔色谱填料与目标物质（>95%）之间的大部分相互作用发生在填料颗粒内部，即孔隙内部，因此孔隙也是色谱填料最重要的参数之一。 填料的孔径（Pore Size）和孔径分布（Pore Size Distribution）在大多数色谱分离和纯化中起着关键作用。

大孔径填料颗粒可以延长大分子溶质在填料表面的停留时间，实现充分分离，改善峰形。 因此，大孔径填料颗粒适合分离大分子化合物或流体动力学体积较大的分子； 较小的孔径提供较高的表面积，可用于较大的负载能力并保留小的有机化合物，可用于将小有机分子分离成聚合物。

孔径与粒径的关系：

样品分子直径必须小于平均孔径才能进入颗粒内部。 所选色谱柱的孔径至少为样品流体直径的4倍。 一般情况下，根据样品的分子量选择合适的孔径。

分子量<2000，选择孔径80~180？

对于分子量>2000，选择孔径300?、300? 全多孔色谱柱可用于分离蛋白质和肽。

7、碳负载量不同

碳负载量越高，固定相的传质效果越大。 高碳负载量有利于不易保留的化合物的分离，并且具有良好的水解稳定性和重现性。 低碳载量有利于在一定程度上保留化合物的分析，降低成本。 溶剂损失，减少运行时间。

8. 封端

硅胶键合相填料中存在一些未封端的残留硅烷醇基团。 封端可以减少待测组分与硅胶表面残留的酸性硅烷醇基团之间的反应，改善保留和峰形，这对于碱性化合物尤其重要。 不同的封端技术也会直接影响色谱柱的性能。