Science重磅 | Orbitrap超高分辨率质谱辅助揭开Z基因组生物合成通路的面纱

近日，天津大学张雁教授联合上海科技大学赵素文教授、美国伊利诺伊大学Huimin Zhao教授等研究团队，在生命科学领域取得突破性研究成果：解析了一种特殊DNA的合成机制，并发现了这种特殊DNA遍布，大量能感染细菌的病毒（这种病毒也称为噬菌体）都含有这种DNA。

这项重大发现对生命起源、物种进化、系统生物学的研究具有重要理论意义。该成果潜在应用价值广阔，包括超级耐药菌感染的ZL、绿色无抗生素畜牧饲料和食品保存技术开发、新型纳米材料制备、DNA信息存贮等。论文于4月30日在国际DJ学术期刊《科学》刊发。天津大学为本项研究成果的DY完成单位。

人类对于生命奥秘的探索从未停止，而基因作为生命的遗传物质自然而然地吸引了很多的研究者。1953年，Waston和Crick教授发现了脱氧核糖核酸（DNA）的双螺旋结构，开启了分子生物学时代，使得人类对于生命的研究到了分子水平，解开了一个又一个生命的奥秘。二位教授也和Wilkins教授一起获得了1962年的诺贝尔生理学和医学奖，以表彰他们在DNA双螺旋结构研究中的突出贡献。

DNA有各种不同形式的修饰，其功能也不尽相同，但是通常情况下其碱基配对方式不会改变，即腺嘌呤（Adenine，A）和胸腺嘧啶（Thymine，T）配对，而鸟嘌呤（Guanine，G）与胞嘧啶（Cytosine，C）配对。

图源: https://www.amoebasisters.com/parameciumparlorcomics/dna-mnemonic

然而1977年前苏联科学家研究发现^[1]蓝藻噬菌体S-2L为Z基因组生物（DNA中只含有Z、G、C、T），其遗传物质DNA中的腺嘌呤（A）完全被二氨基嘌呤（Diaminopurine，Z）取代，Z与T（胸腺嘧啶）碱基配对形成了三个氢键，从而改变了DNA的各种物理、化学性质，其碱基配对方式如下图所示。噬菌体Z基因组的生物通路研究具有重大理论意义。此外，Z碱基已在碳质陨石中被检测到，提示它可能是参与生命起源的核碱基^[2]。

蓝藻噬菌体S-2L的基因组编码一个合成酶PurZ，PurZ为腺苷琥珀酸合成酶（PurA）的同源蛋白。在许多生物体中，PurA和PurB（腺苷琥珀酸裂解酶）通过两步酶促反应将单磷酸肌苷（Inosine monophosphate，IMP）转换为单磷酸腺苷（Adenosine monophosphate， AMP），如下图所示，有研究表明PurZ参与了噬菌体Z-genome的生物合成^[3]。  

为研究Z基因组的生物合成，上海科技大学的赵素文研究员、天津大学的张雁教授和美国UIUC的赵惠民教授课题组对参与Z基因组合成的复合酶进行了研究，并利用紫外-可见光谱和液相色谱-Orbitrap超高分辨率质谱联用技术对噬菌体PurZ的生物活性进行了检测分析。

首先，对噬蓝藻体S-2L（Cyanophage S-2L）的PurZ（CpPurZ）及与其同源性中国的菌株中华杆菌（Sinbacteraceae）噬菌体PurZ（SbPurZ）进行重组表达纯化，并将这两种PurZ复合酶的活性位点同Escherichia coli PurA复合酶（EcPurA）进行比较。

EcPurA的底物为IMP、三磷酸鸟苷（Guanosine triphosphate，GTP）和天冬氨酸（Aspartate，Asp），它可催化GTP的末端磷酸转移至IMP，然后用Asp取代这个磷酸，催化生成腺苷琥珀酸（Adenylsuccinate）^[4]，如下图所示：

在PurA复合酶的GDxxKG基序（其中x为任意氨基酸）中，其催化残基Asp13在PurZ中被Ser残基取代，这两个酶的分子模型如下图所示，由图可清晰地了解到，用体积较小的Ser取代Asp后，PurZ活性口袋就有足够的空间容纳底物（dGMP）中的2号位的氨基，PurZ的底物是脱氧磷酸鸟苷（dGMP），三磷酸腺苷（ATP）和天冬氨酸（Asp）。PurZ酶的催化机理如下图：

为了检测PurZ的催化活性，研究者将PurZ与过量的底物dGMP、ATP和Asp孵育，并检测不同时间点的吸收光谱，对碱基的反应程度进行监测。结果可见，随着时间的增加，紫外-可见光谱在287nm处有明显吸收，表明2-氨基脱氧腺苷琥珀酸（2-aminodeoxyadenylosuccinate）的生成。

为进一步确定PurZ催化反应的中间体及产物，研究者使用UltiMate3000 RSLCnano液相色谱-Q Exactive HF Orbitrap超高分辨质谱联用对反应样品进行了检测，结果显示，相比没有加SbPurZ的样品，加入SbPurZ进行反应后可多检测出两个质谱峰，同标准品进行比对，其精确质荷比表明这两个产物分别为二磷酸腺苷（Adenine 5′-diphosphate，ADP）和2-氨基脱氧腺苷琥珀酸（2-Aminodeoxyadenylosuccinate，ADAS），其中ADAS的碎片离子峰如下图。

噬蓝藻体S-2L没有编码PurB裂解酶，宿主的PurB可能参与了将ADAS转化为dZMP，将SbPurZ的反应产物与EcPurB一起孵育，结果显示ADAS的质谱峰消失，同时出现一个质荷比为345.0718的质谱峰，其一级和二级质谱图如下，经鉴定得知此峰为dZMP，实验结果表明宿主细菌的PurB复合酶参与了dZMP的生成。

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天津大学药物科学与技术学院仪器测试ZX

天津大学药物科学与技术学院（以下简称“药学院”）仪器测试ZX是依据天津大学双YL学科建设的整体目标，为加强学院的基础研究和应用基础研究，培养高水平科技人才，同时实现仪器设备的GX综合利用而建立的公共分析服务平台。在ZX主任瑞藉教授张向阳博士的带领下，遵循“管理规范化，标准国际化，服务专业化与多样化”的理念，经过三年的建设，目前已建成并投入使用的有12个功能实验室:“质谱服务实验室”，“多组学质谱实验室”，“核磁共振波谱实验室”，“晶体衍射实验室”，“蛋白结晶筛选实验室”，“生物成像实验室”，“流式分析与分选实验室”，“生物物理实验室”，“离心分离与制剂实验室”，“光谱分析与元素分析实验室”，“样品制备实验室”，“分子ZX”；另外“信息共享服务与应用平台和数据ZX”即将投入使用。ZX现有专业技术人员9人，教授一人，高级工程师3人，工程师5人；其中具有博士学位5人，硕士4人。拥有各类先进仪器与设备近70台，其中核心设备包括8台质谱仪、2台核磁共振波谱仪、3台晶体衍射仪；元素分析仪；圆二色、振动圆二色、荧光光谱等各类光谱仪；气相与液相色谱仪；流式细胞仪、超高分辨与共聚焦显微镜、超高速离心机等，价值近7000万元。实验室占地1500平方米，位于卫津路校区。

ZX支持与服务的范围，包括性质、成分、结构、成像等领域的定性与定量分析；用户涵盖校内外，包括化工，理学，分子➕，环境，精仪等学院在内的170多个课题组；开放与共享模式多样化，满足用户在不同层次上的科研需求。

为了持续提升ZX的专业水平与管理品质，更好地为药学院和天津大学的科研与教学提供高质量的技术支持与服务，ZX正在申请符合国际标准的CNAS (China National Accreditation Service for Conformity Assessment / 中国合格评定国家认可委员会) 实验室认证。本ZX将继续遵循“科学、公正、准确、满意”的质量方针，不断提高检测的技术水平与服务质量，为天津大学的科研和发展保驾护航。

参考文献：

[1] Kirnos, M. D., et al. "2-Aminoadenine is an adenine substituting for a base in S-2L cyanophage DNA." Nature 270.5635 (1977): 369-370.

[2] Callahan, Michael P., et al. "Carbonaceous meteorites contain a wide range of extraterrestrial nucleobases." Proceedings of the National Academy of Sciences 108.34 (2011): 13995-13998.

[3] Zhou, Yan, et al. "A widespread pathway for substitution of adenine by diaminopurine in phage genomes." Science 372.6541 (2021): 512-516.

[4] Honzatko, Richard B., et al. “Structure±Function Studies of Adenylosuccinate Synthetase from Escherichia coli.” Archives of Biochemistry and Biophysics 370.1 (1999): 1-8.