慢病毒的浓缩与纯化的两种实验方法

慢病毒的浓缩与纯化的实验方法介绍：超速离心沉淀法和 PEG-8000浓缩法.

实验所需仪器：超净工作台，移液器，离心机，振荡器，超低温冰箱

方法一：超速离心沉淀法

1. 取6个Ultra-clear SW28离心管,用70%乙醇消毒后,放在超净工作台中打开紫外灯继续消毒30分钟.

2. 每个Ultra-clear SW28离心管中加入约32ml的预先处理的病毒上清液.

3. 取一支10ml的移液管,吸取12 ml 20%的蔗糖溶液.将移液管一直插入到离心管的底部,缓慢将蔗糖溶液打出4 ml.同样地,将剩下8 ml的蔗糖溶液分别加入到另两个离心管中.另取一支干净的移液管,对剩下3管进行同样处理.

4. 用PBS调整各管的重量,使对应的离心管之间的重量相差不超过0.1g.

5. 按次序将所有6个离心管放入超速离心转头中.

6. 4℃,25,000 rpm. (82,700g) 离心2小时.

7. 小心将管子从转头中取出.倒掉上清,将离心管倒扣在纸巾上放置10分钟使剩余的上清流干.吸掉剩余的液滴.在管底应当有可见的沉淀.

8. 每管中加入100ml 不含钙和镁的PBS洗下沉淀.

9. 将SW28超速离心管插入到50ml锥底离心管中,盖上盖子.

10. 在4℃溶解2小时,每隔20分钟轻轻震荡.

11. 4℃,500g离心1分钟,使溶液集中于管底.

12. 用200μl 移液器轻柔吹打使沉淀重悬.避免产生泡沫.将所有管中的液体集中到一个SW28离心管中.

13. 集中后的病毒悬液分装成50μl 每份,保存在成品管中.用碎干冰速冻后储存在-80 ℃.

方法二：PEG-8000浓缩法

1. 5X PEG8000+NaCl配制 称取NaCl 8.766 g; PEG8000 50g溶解在200ml Milli-Q纯水中；121摄氏度 30min 湿热灭绝 30min；保存在4℃.

2. 使用0.45μm滤头过滤慢病毒上清液；

3. 每30ml过滤后的病毒初始液,加入5X PEG-8000+NaCl母液7.5 ml；

4. 每20～30min混合一次,共进行3-5次；

5. 4度放置过夜；

6. 4度,4000 g,离心 20min；

7. 吸弃上清,静置管子1～2分钟,吸走残余液体；

8. 加入适量的慢病毒溶解液溶解慢病毒沉淀；

9. 集中后的病毒悬液分装成50 μl每份,保存在成品管中.用碎干冰速冻后储存在-80 ℃.