MTT（四唑盐）比色法

　　实验方法原理：MTT法是Mosmann 1983年报道的，以后此方法得到了迅速发展并广泛应用于临床与科研研究。其原理是活细胞中脱氢酶能将四唑盐还原成不溶于水的蓝紫色产物（formazan)，并沉淀在细胞中，而死细胞没有这种功能。二甲亚砜（DMSO）能溶解沉积在细胞中蓝紫色结晶物，溶液颜色深浅与所含的formazan量成正比。再用酶标仪测定OD值。

　　实验材料：细胞样品

　　试剂、试剂盒：PBS，DMSO，胰蛋白酶，甘氨酸缓冲液，二甲亚枫

　　仪器、耗材：加样器，96孔培养板，酶标仪，培养板

　　实验步骤：

　　一、实验前应明确的问题

　　1.  选择适当的细胞接种浓度。一般情况下，96孔培养板的一内贴壁细胞长满时约有105个细胞。但由于不同细胞贴壁后面积差异很大，因此，在进行MTT试验前，要进行预实验检测其贴壁率、倍增时间以及不同接种细胞数条件下的生长曲线，确定试验中每孔的接种细胞数和培养时间，以保证培养终止致细胞过满。这样，才能保证MTT结晶形成酌量与细胞数呈的线性关系。否则细胞数太多敏感性降低，太少观察不到差异。

　　2.  药物浓度的设定。一定要多看文献，参考别人的结果再定个比较大的范围先初筛。根据自己初筛的结果缩小浓度和时间范围再细筛。切记！否则，可能你用的时间和浓度根本不是药物的有效浓度和时间。

　　3.  时间点的设定。在不同时间点的测定OD值，输入excel表，Z后得到不同时间点的YZ率变化情况，画出变化的曲线，曲线什么时候变得平坦了（到了平台期）那个时间点应该就是**的时间点（因为这个时候的细胞增殖YZ表现的Z明显）。

　　4.  培养时间。200 ul的培养液对于10的4~5次方的增殖期细胞来说，很难维持68 h，如果营养不够的话，细胞会由增殖期渐渐趋向G0期而趋于静止，影响结果，我们是在48 h换液的。

　　5.  MTT法只能测定细胞相对数和相对活力，不能测定细胞数。做MTT时，尽量无菌操作，因为细菌也可以导致MTT比色OD值的升高。

　　6.  理论未必都是对的。要根据自己的实际情况调整。

　　7.  实验时应设置调零孔，对照孔，加药孔。调零孔加培养基、MTT、二甲基亚砜。对照孔和加药孔都要加细胞、培养液、MTT、二甲基亚砜，不同的是对照孔加溶解药物的介质，而加药组加入不同浓度的药物。

　　8.  避免血清干扰。用含15%胎牛血清培养液培养细胞时，高的血清物质会影响试验孔的光吸收值。由于试验本底增加，会试验敏感性。因此，一般选小于10%胎牛血清的培养液进行。在呈色后，尽量吸净培养孔内残余培养液。

　　二、贴壁细胞

　　1.  收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，每孔加入100 ul，铺板使待测细胞调密度至1 000-10 000孔，（边缘孔用无菌PBS填充）。

　　2.  5% CO2，37℃孵育，至细胞单层铺满孔底（96孔平底板），加入浓度梯度的药物，原则上，细胞贴壁后即可加药，或两小时，或半天时间，但我们常在前一天下午铺板，次日上午加药。一般5-7个梯度，每孔100 ul，设3-5个复孔.建议设5个，否则难以反应真实情况。

　　3.  5% CO2，37℃孵育16-48小时，倒置显微镜下观察。

　　4.  每孔加入20 ul MTT溶液（5 mg/ml，即0.5% MTT），继续培养4 h。若药物与MTT能够反应，可先离心后弃去培养液，小心用PBS冲2-3遍后，再加入含MTT的培养液。

　　5.  终止培养，小心吸去孔内培养液。

　　6.  每孔加入150 ul二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10 min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD490nm处测量各孔的吸光值。

　　7.  同时设置调零孔（培养基、MTT、二甲基亚砜），对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜）

　　三、悬浮细胞

　　1.  收集对数期细胞，调节细胞悬液浓度1×106/ml，按次序将

　　（1）补足的1640（无血清）培养基40 ul ；

　　（2）加Actinomycin D（有毒性）10 ul用培养液稀释 （储存液100 ug/ml，需预试寻找**稀释度，1：10-1：20）；

　　（3）需检测物10 ul；

　　（4）细胞悬液50 ul（即5×104cell/孔），共100 ul加入到96孔板（边缘孔用无菌水填充）。每板设对照（加100 ul 1640）。

　　2.  置37℃，5% CO2孵育16-48小时，倒置显微镜下观察。

　　3.  每孔加入10 ul MTT溶液（5 mg/ml，即0.5% MTT），继续培养4 h。（悬浮细胞推荐使用WST-1，培养4 h后可跳过步骤4），直接酶联免疫检测仪OD570nm（630nm校准）测量各孔的吸光值）

　　4.  离心（1000转x10min），小心吸掉上清，每孔加入100 ul二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10 min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD570nm（630nm校准）测量各孔的吸光值。  

　　5.  同时设置调零孔（培养基、MTT、二甲基亚砜），对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜），每组设定3复孔。

　　四、MTT的配制

　　MTT一般**现用现配，过滤后4oC避光保存两周内有效，或配制成5mg/ml保存在-20度长期保存，避免反复冻融，**小剂量分装，用避光袋或是黑纸、锡箔纸包住避光以免分解。我一般都把MTT粉分装在EP管里，用的时候现配，直接往培养板中加，没必要一下子配那么多，尤其当MTT变为灰绿色时就不能再用了。

　　MTT有致癌性，用的时候小心，有条件**带那种透明的簿膜手套.配成的MTT需要无菌，MTT对菌很敏感；往96孔板加时不避光也没有关系，毕竟时间较短，或者你不放心的时候可以把操作台上的照明灯关掉.

　　配制MTT时用用PBS溶解，也有人用生理盐水配，60℃水浴助溶。

　　1.  PBS配方

　　（1）NaCl ：8 g。

　　（2）KCl 0.2：g。

　　（3）Na2HPO4 ：1.44 g。

　　（4）KH2PO4：0.24 g。

　　（5）调pH7.4。

　　（6）定容1 L。

　　五、细胞的接种（铺板）

　　细胞过了30代以后就不要用了，因为状态不好了；培养板要用好的（**进口板），不好的板或重复利用的板只可做预实验。

　　接种时**按照预实验摸索出的密度接种， 因为细胞密度在10000/ml左右时，所测得的OD值的区间即细胞YZ率（或者增值率）的所呈现的线性关系**，结果Z可信。如果铺的太稀细胞的杀伤不会很明显，太密细胞可能都会凋亡，因为细胞长的太快营养会不够，Z后导致死亡。且而细胞过密或者过少，增殖都会过快或者过慢，其增值率线性关系不佳。故而MTT细胞密度多采用10000/ml，100 ul/孔。

　　细胞密度要根据不同细胞的特点来定.如果你做的药品对细胞具有刺激作用那么取小点的细胞浓度，如果你做的药品对细胞具有YZ作用那么取大点的细胞浓度，这样与对照的区别更明显，数据更好。悬浮细胞每孔的细胞数可达到105，贴壁细胞可为103-104。