肿瘤疫苗生物学活性评估

肿瘤疫苗背景

肿瘤疫苗，是一种具有预防和治 疗潜力的有吸引力的替代免疫治 疗选择，是近年研究的热点之一。针对肿瘤相关抗原（Tumor-associated antigen,TAA）或肿瘤特异性抗原 (Tumor specific antigen,TSA) 的疫苗可以特异性地攻击和破坏抗原过表达的恶性细胞，并由于免疫记忆而实现慢性治 疗反应。因此，与其他免疫疗法相比，癌症疫苗提供了特异性、安全性和可耐受的治 疗。

根据肿瘤抗原的组分，癌症疫苗大致可以分为四种类型：基于 DNA 的疫苗，基于 RNA 的疫苗，基于多肽的疫苗和基于免疫细胞的疫苗。FDA 批准的首 个个性化肿瘤疫苗 PROVENGE (Sipuleucel-T) 是一种基于免疫细胞的疫苗，用于激素难治性前列腺癌的治 疗。除此之外，Moderna，BioNTech 都在布局基于 mRNA 的肿瘤疫苗。

图 1 肿瘤疫苗抗原呈递平台示意图

肿瘤疫苗有效性评估方法

生物体接种疫苗后，肿瘤抗原被带到淋巴结，进而激活抗原特异性的 B 细胞和 T 细胞，活化的 B 细胞产生的抗体及活化的效应 T 细胞会使肿瘤内胀并诱导肿瘤细胞死亡。

图 2 肿瘤疫苗诱导的免疫反应示意图

如何有效的评估肿瘤疫苗的有效性是一个非常值得探讨的问题，常用的肿瘤疫苗有效性验证的方法，包括细胞因子检测、CTL 活性检测、T 细胞活化标志物检测、抗体滴度检测、ADCC 检测等。

1、细胞因子检测

细胞因子是由免疫细胞经过刺激而合成并分泌的小分子蛋白质，在免疫应答中起着非常重要的作用，因此可以通过细胞因子的分泌能力来反应疫苗诱导的细胞免疫的水平。常见的细胞因子有白介素 (IL) 、干扰素 (IFN)、 肿瘤坏死因子 (TNF) 等。下面比较了几种常见的检测方法。

ELISA 是一种非常经典的细胞因子的检测方法，例如在王晓东等人发表的关于胃癌疫苗研究的文章中，提到了用 ELISA 的方法检测接种疫苗后小鼠骨 髓源树突状细胞（BMDCs）分泌细胞因子的能力，检测方法如下：

BMDCs 在含有 10ng/mL GM-CSF 和 10ng/mL IL-4 的 X-vivo 15 培养基中培养，37℃下培养 6 天，然后以每孔 5×104 细胞的密度在 96 孔板中接种。以 5µM 或 10µM 的Z 终浓度加入疫苗抗原，孵育 24 小时。使用小鼠 TNF-α 和 IL-12 p70 ELISA Ready-SET-Go 试剂组定量培养上清中的 TNF-α 和 IL-12 。首先在 4℃下用捕获抗体包被 ELISA 板过夜，然后在室温下依次加入阻断液、细胞培养上清和检测抗体，孵育 1h 。 Z 后加入终止液和显色剂，用酶标仪 (BioTek) 在 450nm 处记录 OD 值。

检测结果如下：

从检测结果可以看出，T7（TLR7 激动剂）的存在可以显著提升 ML/MB 抗原诱导的免疫反应。

图 3 ELISA 法测定小鼠骨 髓树突状细胞 (BMDCs) 分泌

TNF-α (a) 和 IL-12 (b) 的水平

Ankita Leekha 等人发表的关于 SRAS-COV2 疫苗文章中，提到了用 ELISPOT 的方法评估细胞因子的分泌水平，可以作为参考。具体方法如下：

从小鼠中分离脾细胞和肺细胞，使用小鼠 IFNγ ELISpot 基础试剂盒和小鼠 IL4 ELISpot 基础试剂盒 (Mabtech, VA, USA) 进行 IFNγ 和 IL4 ELISpot 检测。在 37℃ 下，在预包被抗体的 ELISpot 板中，用抗原刺激脾细胞和肺细胞，培养 16-18 小时。第二天，洗掉细胞，加入生物素化的检测抗体。洗板后，加入 1:30000 稀释的 Extravidi-ALP 偶联物，室温孵育 1 小时。洗板后，每孔添加 70µL 显色液，孵育 20-30min，形成斑点，然后用水清洗，干燥。使用 Cytation 7 (BioTek) 对斑点进行量化。每个点对应一个单独的细胞因子分泌细胞。

检测结果如下：

图 4 ELIPSOT 方法检测小鼠脾细胞

和肺细胞分泌细胞因子的水平

2、CTL 活性检测

疫苗诱导的细胞毒性 T 淋巴细胞 (CTL) 可以直接杀伤肿瘤细胞，起到抗肿瘤的作用，因此可以通过检测 CTL 的杀伤效应来反应疫苗的效果。常用的检测细杀伤效应的方法有很多，下表列举了一些常用的方法。

王晓东等人发表的文章中提到了 LDH 检测，检测方法如下：

从接种疫苗小鼠的脾 脏中分离淋巴细胞（效应细胞）。EAC 肿瘤细胞（靶细胞）与淋巴细胞（效应细胞-靶细胞比例为 50:1）共培养 4h，使用乳酸脱氢 (LDH) 法测定细胞毒性。将培养 4h 后的培养上清加入在 ELISA 板中，室温下加入底物溶液，孵育 30min。Z 后，加入终止液终止反应，并用酶标仪 (BioTek) 在 490nm 处检测光密度。

检测结果如下：

相对于 PBS 对照组来说，T7-MB 组 CTL 细胞具有显著的杀伤效应。

图 5 LDH 法测定 CTL 介导的 EAC 靶细胞的裂解水平

3、抗体滴度及亲和力检测

肿瘤疫苗除了可以诱导细胞免疫之外，也可诱导体液免疫，对此可通过对抗体滴度及亲和力进行检测来反应疫苗抗肿瘤的效果，ELISA 是一种非常经典的检测方法。

上述关于胃癌疫苗的文章中通过 ELISA 方法测定小鼠接种疫苗后血清中总 IgG 含量，具体检测过程如下：

小鼠接种疫苗后收集血液样本，通过 3000g 离心 15 分钟获得血清样本。ELISA 板预先在 4℃ 包被 BSA-MG1 过夜，然后在室温下依次加载封闭溶液 2h，血清样品 (1:50 稀释) 和检测抗体 1h。Z 后，在体系中加入 p-NPP 底物 (Millipore) 和终止液，用酶标仪 (BioTek) 在 405nm 处记录 OD 值。

检测结果如下：

相对于 PBS 对照组来说，T7-MB 组抗体含量明显上升。

图6 ELISA法测定疫苗诱导的血清抗体水平

除此之外，在 Emily C. Gale 等人发表的关于 mRNA 递送系统及辅剂研究的文章中，通过 ELISA 的方法测定了 mRNA OVA 模式疫苗诱导的 OVA 特异性抗体的绝 对含量及其亲和力。具体检测方法如下：

抗体浓度：小鼠接种加强疫苗后，采集血液样品，血清按照 1:100 000 进行稀释。采用 anti-OVA mouse IgG1 ELISA (Cayman Chemicals) 试剂，按照试剂厂家的说明进行 ELISA 实验。使用 Synergy H1 Microplate Reader (BioTek) 在 450nm 处记录 OD 值。根据标准曲线计算血清抗体浓度，表示 mg/mL。

抗体亲和性：将 12 个梯度稀释的血清与恒定浓度标记 HRP 的 anti-OVA 抗体 (3nM) 混合，并在 OVA 抗原包被的板中室温孵育 2 小时，洗板后用 TMB 底物孵育，用 HCl 停止反应。测定 450nm 处的 OD 值。根据业内发现的单克隆抗体的共同亲和力，假设对照抗体的 KD 为 1nM 对实验组的 KD 值进行统计。这一假设仅影响报告的绝 对 KD 值，而不影响实验组之间的相对差异。

检测结果如下：

pIC 为双链 RNA 结构模拟物，图E中比较了可溶性的 pIC 和不同纳米颗粒递送系统诱导的绝 对抗体含量，从图 E 中可以看出 2B 递送系统诱导的 OVA 特异性抗体含量Z 高。从F和G可以看出 2B 递送系统相对于可溶性 pIC 来说诱导的 IgG 亲和力也显著升高。

图 7 pIC/PBAE NPs 增强体液免疫

4、ADCC 检测

疫苗诱导体液免疫产生的抗体能够捕捉目标抗原，阻断这个靶分子的功能，也可以引导其他免疫细胞（如巨噬细胞和自然杀伤细胞）杀死表达抗原的靶细胞，在肿瘤治 疗中，特别是血液肿瘤中，抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用 (ADCC) 起着关键作用，ADCC 常用的检测方法包括细胞活力检测、LDH 检测、工程细胞株、Delfia、RTCA、细胞成像检测等。

王晓东等人发表的关于胃癌疫苗研究的文章中，提到了 LDH 方法检测 ADCC，检测方法如下：

小鼠接种疫苗后，采集其血清样本（1:25 稀释），然后与 EAC 细胞（靶细胞）在 37°C 孵育 30min。使用小鼠 NK 细胞分离试剂盒从正常 BALB/c 小鼠中分离出自然杀伤 (NK) 细胞（效应细胞），与抗体标记的 EAC 细胞以效靶比 50:1 共培养 4 小时。采用 LDH 法 (Promega) 测定细胞毒性，检测方法与之前提到的 CTL 活性检测的方法一致。

检测结果如下：

相对于 PBS 对照组来说，T7-MB 组产生的抗体具有显著的杀伤效应。

图 8 LDH 法测定血清抗体介导的 EAC 靶细胞的裂解水平

肿瘤疫苗生物学活性检测解决方案推荐

本文介绍了肿瘤疫苗活性检测的常用方法，包括细胞因子检测、CTL 活性检测、抗体滴度及亲和力检测、ADCC 检测等方法，涉及到了酶标仪、成像系统、流式、RTCA、洗板分液系统等设备。Agilent 细胞分析事业部可以从多个角度为用户提供从样品处理，到结果检测再到数据分析的全面解决方案。