树突状细胞肿瘤疫苗中RNA修饰机制研究进展

摘要

近年来，树突状细胞（DC）肿瘤疫苗在免疫治疗领域展现出重要潜力。本研究聚焦RNA修饰技术对DC疫苗功能的影响，通过优化RNA转染效率及稳定性，探索其激活抗肿瘤免疫的分子机制。实验表明，化学修饰的RNA可显著提升DC抗原呈递能力，并通过动物模型验证了疫苗的抑瘤效果。本研究为RNA修饰技术在肿瘤疫苗开发中的应用提供了理论依据。

引言

树突状细胞作为抗原呈递的核心细胞，其肿瘤疫苗的研发是肿瘤免疫治疗的重要方向。传统DC疫苗依赖外源性抗原负载，存在递送效率低、免疫原性不足等问题。RNA修饰技术通过引入化学基团（如假尿嘧啶、5-甲基胞嘧啶）可增强RNA稳定性并降低先天免疫识别，从而提高DC的抗原呈递效率。然而，RNA修饰类型、修饰位点与DC功能调控的关联机制尚未明确。本研究系统评估了不同RNA修饰策略对DC成熟标志物、细胞因子分泌及T细胞激活能力的影响，结合体内外实验阐明其作用通路，为临床转化提供优化方案。

实验部分

1. 材料与方法

1.1 实验材料

1. 细胞来源：健康供体外周血单核细胞（PBMC）分化为未成熟DC（imDC）。

2. 试剂：某试剂RNA体外转录试剂盒、某试剂细胞因子检测试剂盒、某试剂脂质体转染试剂。

3. 仪器：威尼德电穿孔仪（参数：电压300 V，脉冲时长5 ms）、威尼德紫外交联仪（能量剂量150 mJ/cm²）。

1.2 DC的分离与培养
采用密度梯度离心法分离PBMC，以GM-CSF（50 ng/mL）和IL-4（20 ng/mL）诱导imDC分化，培养第5天通过流式检测CD11c⁺CD83⁻表型确认纯度＞90%。

1.3 RNA的制备与修饰

1. 模板设计：构建编码肿瘤抗原（如NY-ESO-1）的mRNA，引入5'帽子结构及3' polyA尾。

2. 化学修饰：采用某试剂核苷酸类似物，在转录过程中将尿嘧啶替换为N1-甲基假尿嘧啶（m1Ψ），修饰比例设定为20%、50%、80%三组。

3. 质量控制：威尼德分子杂交仪检测RNA完整性（RIN＞8.0），Nanodrop测定浓度与纯度（A260/A280=1.8-2.0）。

1.4 DC疫苗制备与功能验证

1. RNA转染：使用威尼德电穿孔仪（优化参数：电压250 V，电容950 μF）将修饰后mRNA导入imDC，转染后24小时检测EGFP报告基因表达效率（＞70%为合格）。

2. DC成熟诱导：转染后添加LPS（100 ng/mL）刺激48小时，流式检测CD80、CD86、HLA-DR表达水平。

3. 细胞因子检测：ELISA法测定培养上清中IL-12p70、IFN-γ及TNF-α浓度。

1.5 体内抗肿瘤效应评估

1. 动物模型：BALB/c小鼠皮下接种CT26结肠癌细胞（5×10⁵/只），随机分为PBS对照组、未修饰RNA疫苗组、修饰RNA疫苗组（n=8）。

2. 免疫方案：肿瘤直径达5 mm时，皮下注射1×10⁶负载RNA的DC，每周1次，共3次。

3. 疗效评价：监测肿瘤体积（游标卡尺测量）及生存期；处死后分离脾细胞，通过威尼德原位杂交仪检测抗原特异性T细胞比例。

1.6 分子机制分析

1. TLR信号通路检测：Western blot分析MyD88、TRIF蛋白表达；某试剂双荧光素酶报告系统评估NF-κB活性。

2. RNA稳定性测试：将修饰后RNA置于37℃血清环境中，威尼德紫外交联仪定时取样检测降解速率。

2. 结果与分析

2.1 RNA修饰显著提升DC疫苗效能

50% m1Ψ修饰组的DC成熟标志物（CD86⁺比例达82.3±4.1%）及IL-12p70分泌量（285.6±32.7 pg/mL）均显著高于未修饰组（p<0.01）。

修饰后RNA在血清中的半衰期延长至未修饰组的3.2倍（24.5 h vs 7.6 h）。

2.2 体内实验验证抗肿瘤效果

修饰RNA疫苗组小鼠肿瘤体积较对照组缩小67.4%（p<0.001），中位生存期延长至38天（对照组21天）。

脾细胞中抗原特异性CD8⁺T细胞比例提高至14.2±2.8%（未修饰组5.1±1.3%）。

2.3 机制解析：TLR信号通路抑制与抗原呈递增强

修饰RNA使TLR7/8通路关键接头蛋白MyD88表达下调40%，NF-κB活性降低62%。

RNA稳定性提升使抗原表达持续时间延长至72小时（未修饰组24小时）。

讨论

m1Ψ修饰通过双重机制优化DC疫苗功能：一方面降低TLR介导的免疫原性，避免DC过早凋亡；另一方面延长抗原表达时间，促进CD8⁺T细胞交叉激活。威尼德电穿孔仪的高效转染技术（＞70%效率）为实验成功提供了关键保障。未来需进一步探索不同修饰模式的组合效应及临床级生产工艺的适配性。

结论

RNA化学修饰可有效增强DC肿瘤疫苗的抗原呈递能力与体内抗肿瘤活性。本研究建立的修饰策略与评价体系为个体化疫苗开发提供了新思路，同时验证了威尼德系列仪器在RNA疫苗制备中的稳定性和适用性。

参考文献

1. A full scale comparative study of methods for generation of functional Dendritic cells for use as cancer vaccines.[J].Silvija; Jarnjak-Jankovic;Hege; Hammerstad;Stein; Saeb?e-Larssen;Gunnar; Kvalheim;Gustav; Gaudernack,BMC cancer.2007,第7期

2. A phase II study of adoptive immunotherapy using dendritic cells pulsed with tumor lysate in patients with hepatocellular carcinoma.[J].Mirza N;Steven NM;Adams DH;Young LS;Ahmed F;Palmer DH;Torr EE;Kerr DJ;Midgley RS;Steele JC,Hepatology: Official Journal of the American Association for the Study of Liver Diseases.2009,第1期

3. A survey of telomerase activity in human cancer[J].J.W. Shay;S. Bacchetti,European Journal of Cancer.1997,第5期

4. Antigen loading of DCs with irradiated apoptotic tumor cells induces improved anti-tumor immunity compared to other approaches[J].Shand;J.L.;Milliron;M.;Tasian;S.K.;Fry;T.J.;MacKall;C.L.,Cancer Immunology & Immunotherapy: Other Biological Response Modifications.2009,第8期

5. Autologous dendritic cells transfected with prostate-specific antigen RNA stimulate CTL responses against metastatic prostate tumors.[J].Heiser Axel;Coleman Doris;Dannull Jens;Yancey Donna;Maurice MargaretA;Lallas CostasD;Dahm Philipp;Niedzwiecki Donna;Gilboa Eli;Vieweg Johannes,The Journal of Clinical Investigation: The Official Journal of the American Society for Clinical Investigation.2002,第3期

6. Balancing between immunity and tolerance: an interplay between dendritic cells, regulatory T cells, and effector T cells.[J].Cools N;Ponsaerts P;Berneman ZN;Van-Tendeloo VF,Journal of Leukocyte Biology: An Official Publication of the Reticuloendothelial Society.2007,第6期