关于凋亡检测的7个技巧

1、确保使用正确的缓冲液

Annexin V是钙离子依赖性蛋白，主要结合到磷脂酰丝氨酸。这些磷脂一般都是朝向细胞内的，在早期凋亡时，这些磷脂会反转向外。通过Annexin V和透膜的染料（如7-AAD或PI），可区分早期和晚期凋亡。Annexin V的结合依赖于钙离子，所以需要在标记时确保使用含钙离子的缓冲液。

2、Annexin V结合不稳定

与抗体结合不同，Annexin V的结合不稳定，也不容易被固定，所以在标记结束后1－3小时内必须要上机检测。

3、设计正确的实验

确保试剂可诱导凋亡，而不是诱导坏死。sub-G1检测凋亡常常会被错用，尽管在用标准DNA染料检测时，凋亡细胞的DNA峰将会出现在G1峰左侧。然而，如果实验设计不正确，亦将会导致错误的假性结果。

4、查看你的固定液

甲醛固定液可导致DNA小碎片出现，从而会使凋亡假性增多，所以切勿固定。

5、必要时考虑TUNEL

对于贴壁细胞，细胞膜容易在消化时受损，产生Annexin V假阳性，故对于贴壁细胞，可考虑TUNEL法。TdT介导的dUTP末端标记（TUNEL）法使用TdT标记使DNA断裂末端标记上dUTP，从而可被抗BrdU抗体检测到。此时，你就需要使用甲醛固定液。

线粒体膜电位丢失也是凋亡早期发生的标志之一，同时细胞凋亡时还会释放细胞色素C，从而导致caspase活化。这些方法也可以用在贴壁细胞上。

6.小心选择染料

检测线粒体膜电位有三种染料：罗丹明123、DiOC6(3)、JC-1。罗丹明123需要与PI配合使用，可区分活细胞（罗丹明123阳性）、早期凋亡（罗丹明123）、晚期凋亡（PI阳性）。JC-1在凋亡发生时，可从绿色荧光转换为橙色荧光。

7、不要过度解读数据

有些论文认为线粒体膜电位可能并非凋亡的关键步骤，所以，检测活化caspase就非常重要。

Z后要提一下，各种检测凋亡的方法都有优点和缺点，所以如何去解读它非常重要，了解凋亡的发生机制很关键。