大刊JCI，CAR T+EV外泌体研究显著降低神经毒性综合症， 3D全自动外泌体荧光检测分析系统助力解锁关键数据

    嵌合抗原受体T细胞（CAR T）免疫疗法是治疗恶性肿瘤的新兴手段，抗CD19嵌合抗原受体T细胞（CD19.CAR T）在B细胞恶性肿瘤治疗疗效显著，但常伴有免疫效应细胞相关神经毒性综合征（ICANS）这一不良反应，其临床特征包括脑病、认知障碍、语言障碍、癫痫发作以及较少见的脑水肿。虽然ICANS致死率低（1%–2%），但其治疗需要使用大剂量类固醇和免疫抑制疗法，会影响CAR T细胞活性和治疗效果，并增加非复发性死亡率。近期，博洛尼亚大学发表题为 “CAR+ extracellular vesicles predict ICANS in patients with B cell lymphomas   treated with CD19-directed CAR T cells”为题的文章，借助3D全自动外泌体荧光检测分析系统揭示了CAR+细胞外囊泡（CAR+EVs）在预测和理解这种神经毒性反应中的重要作用，为研究者预防和管理CAR T细胞治疗的神经毒性反应提供了新的思路，对推动 CAR T 细胞免疫疗法安全应用与持续发展意义重大。

    文中使用的3D全自动外泌体荧光检测分析系统是法国Abbelight公司设计研发的，是一款无需纯化、可全自动表征分析单个外泌体的创新设备。它能够提供外泌体粒径、亚型分布、携带蛋白表达及单个外泌体的膜蛋白与生物标志物共定位等全方位信息，操作简单，结果可靠。设备特有的单分子定位成像技术，可获得精度高达20 nm的单个外泌体的超分辨成像结果，为该研究提供了关键的技术支持。

3D全自动外泌体荧光检测分析系统

    研究者针对100名B细胞淋巴瘤患者开展实验，为其注射CD19.CAR T细胞，在30天内一共有29人引发了ICANS。患者的血样结果表明，患有ICANS的患者与未患ICANS的患者的CAR T细胞扩增峰值与30天内的曲线下面积（AUC）无显著差异，但到达峰值的时间（TTP）更短（图1），同时CAR_DNA水平到达峰值的时间也更短（图2），这种动力学上的差异代表着CD19.CAR T细胞更快地到达病灶并激活。

图1

图2

    先前已有研究指出，CAR   T细胞具备分泌携带有CAR的外泌体（EV）的能力。研究者进一步提出假设，认为CAR T血浆外泌体的检测可以提供CAR T细胞的迁移和功能的信息。首先在含/不含CD19+靶细胞的环境下分别培养了19BBζ.CAR T和19BBζ.eGFP.CAR T细胞。24小时后，收集培养上清并使用包被了CD63，CD81和CD9抗体的玻片捕获了外泌体，之后使用3D全自动外泌体荧光检测分析系统进行超分辨成像可以确认在CD19+靶细胞共培养的19BBζ.eGFP.CAR   T细胞上清中含有CAR+EV（图3A）；单外泌体STORM成像同样确认在CD19+共培养的19BBζ.CAR T细胞上清中也含有CAR+EV（图3B&C）；将共聚焦与STORM成像的数据结合，能够确认19BBζ.CAR T的细胞质中含有大量CAR+EV（图3D&E）。STORM成像结果的共定位分析可以看出，19BBζ.CAR T和19BBζ.eGFP.CAR T细胞中的大多数外泌体的CD19.CAR蛋白与CD63以单个分子的水平显示位于同一外泌体上，即两者共定位（图3F&G）。以上结果表明，在CD19+靶细胞诱导下，CD19.CAR蛋白以与CD63共定位的CAR+EV的形式大量释放到了细胞上清中。

图3 19BBζ.CAR   T与19BBζ.eGFP.CAR T细胞的STORM/共聚焦成像分析

    基于细胞实验结果，研究者对接受了CAR.T治疗的患者的血浆进行了流式（图4左）和STORM检测（图4右），在血浆中发现了带有外泌体和T细胞标记物的CAR+EV。进一步统计分析显示，后续发病的ICANS患者的day+1的CAR+EV数量（图5A），CAR+EV的药代动力学数据（图5B）及AUC（图5C），CAR+EV浓度的峰值（图5E），hour+1和day+1的水平（图5F）均显著增高；ROC分析显示，hour+1时132.8   CAR+EV/μL以上的浓度的预测ICANS发生具有89.29%的灵敏度和74.58%的特异性，day+1时224.5 CAR+EV/μL以上的浓度的预测灵敏度和准确性可达96.55%和 80.36%（图5G）。

图4 血浆内CAR+EV的流式和单外泌体成像

图5 血浆CAR+EV：早期ICANS标记物

    在本研究中可以发现，CAR+EV的释放是CD19.CAR T细胞在体外激活的信号，因为CAR+EV主要在识别靶细胞后释放。3D全自动外泌体荧光检测分析系统的STORM成像结果表明，多数CAR+EV上含有标记蛋白CD63，来源于CD19.CAR T细胞的细胞质中预组装成的富含CD63的颗粒。STORM成像也证实了接受CAR T治疗的病人血浆中含有外泌体标记物和CAR蛋白的CAR+EV；由于CD19.CAR   T细胞的激活在ICANS患者中显著上升，血浆CAR+EV水平可以作为可信的早期ICANS指标。

参考文献：

[1]. Storci,   G., De Felice, F., Ricci, F., Santi, S., Messelodi, D., Bertuccio, S. N., ... & Bonifazi, F. (2024). CAR+ extracellular vesicles predict ICANS in patients with B cell lymphomas treated with CD19-directed CAR T cells. The Journal of Clinical Investigation, 134(14).