成果展示丨《SENSOR ACTUAT B-CHEM》李备团队成功构建微生物单细胞拉曼光谱检测与液体分离培养一体化功能平台

自然界中大部分微生物尚未获得纯培养，单细胞技术在微生物生态研究中发挥着至关重要的作用。然而，由于微生物样品复杂、杂质多，细胞形态差异大、易彼此粘黏，目标菌丰度低等问题，传统单细胞检测与分离技术（如流式细胞术等）对微生物样品的适用性不强。而基于激光诱导正向转移(LIFT)原理的单细胞分选技术，由于分选精度高、杂质兼容性强、可视化等特点，在很大程度上解决了上述问题。该技术与共聚焦拉曼光谱技术的结合，可实现对复杂微生物样品中功能菌的有效识别与筛分，极大提高了功能菌筛选与研究效率。为进一步提升LIFT分选技术的适用性，本研究将微阵列分选芯片与 LIFT技术结合，开发了一种用于液体中单个微生物细胞拉曼光谱检测及自动分选的平台（功能化微孔激光分选平台，FMLS），为微生物单细胞研究提供了新型有力工具。

本研究设计并制作了一款新型功能化微阵列分选芯片，并与PRECI SCS-R300拉曼单细胞分选仪组成了功能化微孔激光分选平台（FMLS），实现单细胞的拉曼光谱检测与精准分离。其中，微阵列分选芯片上设计集成了数十万个微阵列小室，用于捕获液体中的微生物单细胞，并统计了微孔对单细胞的捕获效率。随后，为验证该芯片在分选过程中对小室中的细胞无高温损伤，进行了分选过程的温度模拟。同时，本文采用了多种微生物（包括大肠杆菌、酿酒酵母、胶红酵母等）对FMLS系统进行测试，确定其拉曼光谱检测与分选能力，以及维持高细胞活性和保留基因组信息的能力。

图1 FMLS系统对单细胞鉴定分离培养流程

1. 微孔弹射芯片的设计

本研究设计的微阵列芯片上集成了70万个微孔，孔径可根据分选细胞的大小进行定制。分选过程的温度模拟展示了微孔中的温度分布（图2 a）。结果显示，随着与激光点距离的增加，液体温度呈现骤降。在短暂的激光脉冲暴露期间，高温被限制在极小的范围内，周围液体温度保持在 30 °C 以下。当微孔芯片翻转时，细胞在重力作用下远离激光焦点（图2 b），微生物细胞保持在安全温度范围内，并且在分选过程中不受温度扩散的影响，确保了微生物分选过程的可行性。

图2 微阵列分选过程的温度分布模型和单个细胞的共聚焦 3D 图像

图a为微孔内温度变化、激光作用的垂直距离和持续时间之间相关性的 3D 表面映射；图b为微孔中捕获的单个微生物细胞的共聚焦3D图像（横截面），上边界代表芯片表面

采用荧光标记酿酒酵母来统计微阵列芯片的单细胞捕获率，结果如图3所示，在普通芯片上酿酒酵母会迁移呈环状（图3 a），在环状边缘部分聚集（图3 b）。而在微阵列芯片上，不同浓度的酿酒酵母均匀分散在微阵列中（图3 c-e）。在5×10⁷ cells/mL样品浓度下，统计不同尺寸微生物的捕获率，结果显示，直径为1 μm左右的大肠杆菌和5 μm的酵母分别能够达到90.32%和90.64%；直径为3 μm左右的蓝藻单细胞捕获率可达82.55%，直径为10 μm左右的衣藻可达81.98%。总体而言，微阵列芯片的单细胞捕获率普遍能达到80%以上。

图3 微生物单细胞捕获性能评估

图a 荧光标记的酿酒酵母在普通芯片上的环状成像效果；图b为a中环上的酿酒酵母放大效果；图c-e分别为10⁷ ，5×10⁷, 10⁸ cells/mL浓度下微阵列芯片上的单细胞捕获效果；图f为不同浓度下单细胞捕获率的统计；图g为不同尺寸的微生物在不同孔径的微阵列芯片上的平均捕获率统计；图h为微阵列芯片倒置时的明场显微成像

进一步采用PRECI SCS-R300拉曼单细胞分选仪识别并分离培养了酿酒酵母（S. cerevisiae）和类胡萝卜素标记的胶红酵母（R. mucilaginosa）这2种形态相似的微生物。基于类胡萝卜素特征峰识别胶红酵母单细胞（图4 b）。通过对盖玻片上接收到细胞的显微成像评估分选效果。如图4所示，相邻微孔中的细胞分选后，在盖玻片上可以观察到与微孔排列相近的细胞位置排列，体现了FMLS平台精准可靠的分离效果。此外，采用不同的激光能量对不同微生物单细胞进行测试，结果显示在激光能量达到一定阈值（120 nJ）后，分选效率近乎达到100%（图4 j）。

图4 液体环境下单细胞的鉴定与分离

图a为两种酵母细胞的单细胞特征光谱均谱，有色区域表示单细胞测量的标准差；图b为混合样品中分类后的胶红酵母的拉曼光谱；图c为常规LIFT液体分选的动态过程图像；图d为三个相邻微孔中单细胞捕获的显微照片；图e-g为依次分离三个微孔中单个微生物的分选过程；图h为空白盖玻片的显微成像；图i为三个分离单细胞的精准接收；图j为不同激光能量下不同微生物单细胞的分选效率

为证实FMLS系统的低损伤性，分别对大肠杆菌和酿酒酵母进行单细胞分选培养。结果表明，大肠杆菌和酿酒酵母的单细胞分选存活率分别约为97.2%和95.8%（图5 a,b）。另外，对培养的大肠杆菌和酿酒酵母分别进行了16S rRNA序列验证，证实了物种信息（图5 c,d），并进一步对分离得到的大肠杆菌单细胞进行了全基因组扩增与单细胞重测序，其单细胞基因组覆盖度达到88%，进一步证实了FMLS平台在微生物单细胞培养及测序方面的应用价值。

图5 细胞活力分析和分离单细胞物种鉴定

图a为大肠杆菌和酿酒酵母单细胞分选后孵育36小时的照片；图b为分选单细胞孵育36小时后的存活率统计；图c为分选培养的大肠杆菌单细胞菌落(D1-D8)凝胶电泳图，CD为细胞悬液对照；图d为分选培养的酿酒酵母单细胞菌落16S rRNA凝胶电泳图

本文开发了一种结合微阵列芯片与PRECI SCS-R300拉曼单细胞分选仪的新型功能化微孔激光分选平台（FMLS），实现了液体中活体微生物单细胞的高效、准确捕获、拉曼光谱检测与可视化精准分选。FMLS系统在捕获效率、检测特异性、细胞活性保持及基因组覆盖率等方面表现出显著优势，为微生物学提供了一种极具价值的单细胞研究工具。

在本研究中，微阵列芯片与的PRECI SCS-R300拉曼单细胞分选仪联合组成了功能化微孔激光分选平台，实现了对液体环境中不同种类、尺寸的活体微生物单细胞的无损、精准分离。由于LIFT分选技术具有杂质兼容性高、样品适用性强、分选准确率高等特点，有效解决了当前微生物单细胞检测与分离的技术难题，在环境及生物医学研究中具有重要意义。

本文中研制的微阵列芯片已由成功转化为产品——HoneyArray微阵列分选培养芯片，该芯片具有保水及蜂巢状微阵列设计，点样后微生物单细胞会进入微阵列的各孔内，此时可应用PRECI SCS系列产品进行单细胞显微成像、拉曼光谱检测与活体分离，分选得到的细胞可进行培养及测序等下游实验。

X-Lab是中国科学院长春光机所李备研究员带领的科研创新实验室，与牛津大学、格拉斯哥大学、卡迪夫大学等国际顶尖光学及微流控等领域科学家合作，专注于细胞操纵、拉曼光谱、共聚焦成像、微流控和人工智能五大核心领域。实验室目前拥有近20位硕博士科研团队，发表SCI论文20余篇，承担国家及省部级研发项目10余项，展现出强大的研发和创新能力。X-Lab作为的前沿技术探索与储备力量，将持续推出创新科研成果。

牛津大学生物工程学教授。牛津大学圣埃德蒙学院Fellow。在国际优秀学术期刊发表SCI论文160余篇，包括《Nature》和《Science》系列子刊如Nature Microbiology, Nature Communications, Science Advances, PNAS, ISME Journal, British Journal of Cancer等，并多次荣获国际大奖。目前担任国际期刊Environmental Microbiology和Microbial Biotechnology的编辑。主要研究领域是微生物分子生物学和单细胞生物学。率先提出并发展了包括拉曼光镊分选，拉曼弹射分选，拉曼微流控分选，拉曼-荧光探针和拉曼-同位素探针等多项创新技术。此外，黄教授在生物传感器技术的开拓中发挥了关键作用，是超声波核酸转移细胞技术的发明者。截至目前，拥有60余项专利，多项发明成果成功实现产业化。

冯世伦博士，硕士毕业于挪威东南大学，博士毕业于澳大利亚麦考瑞大学，于新加坡南洋理工大学从事博士后研究，现任中国科学院上海微系统与信息技术研究所传感技术国家重点实验室集成光电生化传感器负责人/副研究员、上海市体外诊断芯片技术创新中心生物微流控芯片首席科学家等，同时担任中国微米纳米协会生物微机电理事、中国转化医学联盟暨中国精准医学学会理事；曾获上海市海外领军人才（青年）、上海市浦江人才等荣誉。先后主持项目/课题8项；担任SCI期刊 Micromachines 编委，Chinese Chemical Letters、View、BMemat等青年编委。发表高质量SCI论文80余篇，引用约2000次；授权发明专利6项；主要攻关于病原体相关生物微流控芯片以及便携式即时现场检测（POCT）系统整机研制，多款整机装备已经进行转化应用。